ĽUDSKÁ GENOMIKA
genetika prírody
Sekvenovanie s dlhým čítaním identifikuje expanzie opakovania GGC v NOTCH2NLC spojené s neuronálnym intranukleárnym inklúznym ochorením
ONT resekvenovanie |Illumina |Sekvenovanie celého exómu |CRISPR-Cas9 ONT cielené sekvenovanie |RNA-sekv |ONT 5mC metylačné volanie
Zvýraznenie
1. Analýzou väzby na veľkej rodine NIID boli identifikované dve spojené oblasti.
2. Long-read sekvenovanie založené na ONT a Cas-9 sprostredkované obohatenie ONT sekvenovanie objavilo potenciálnu genetickú príčinu NIID, expanzie opakovania GGC v 5′ UTR NOTCH2NLC.Táto štúdia po prvýkrát zaznamenala opakované expanzie v génoch špecifických pre človeka, ktoré sa vyvinuli prostredníctvom segmentových duplikácií.
3. Sekvenovanie RNA odhalilo abnormálne antisense transkripty na začiatku alebo vo vnútri oblastí expanzie opakovania GGC v NOTCH2NLC.
Pozadie
Neuronal intranuclear inclusion disease (NIID) je progresívne a fatálne neurodegeneratívne ochorenie, ktoré je charakterizované prítomnosťou eozinofilných hyalínových intranukleárnych inklúzií v centrálnom a periférnom nervovom systéme.Jeho veľmi variabilné klinické prejavy spôsobujú veľké ťažkosti v diagnostike až do zavedenia biopsie kože.Metódy založené na histopatológii však stále trpia nesprávnou diagnózou, ktorá si vyžaduje genetické pochopenie NIID.
Úspechy
Analýza väzieb
SHort-read sekvenovanie založené na sekvenovaní celého genómu (WGS) a sekvenovanie celého exómu (WES) sa uskutočnilo na veľkej rodine NIID (13 postihnutých a 7 nepostihnutých členov).Analýza väzieb na SNP extrahovaných z týchto údajov odhalila iba dve spojené oblasti: oblasť 3,5 Mb na 1p36.31-p36.22 (maximálna LOD = 2,32) a oblasť 58,1 Mb na 1p22.1-q21.3 (maximálna LOD: 4,21 ).V týchto spojených oblastiach však neboli identifikované žiadne patogénne SNP alebo CNV.
Opakované expanzie GGC v NOTCH2NLC
NSekvenovanie založené na anopore bolo spracované na 13 postihnutých a 4 nepostihnutých členoch z 8 rodín (ďalší postihnutý člen bol sekvenovaný pomocou sekvenčnej platformy s dlhým čítaním Pacbio.).Dlhodobo prečítané údaje odhalili expanzie opakovania GGC súvisiace s ochorením v 5'UTR mapovania génu NOTCH2NLC na oblasť spojenú s 58,1 Mb (obrázok 1).Tieto opakované expanzie boli tiež identifikované vo všetkých 40 sporadických prípadoch NIID testovaných pomocou RP-PCR.
CCieľové sekvenovanie sprostredkované as-9 na nanopórovej platforme sa použilo na dosiahnutie vyššieho pokrytia čítania na opakovaní NOTCH2NLC (100 X-1 795 X).Tieto konsenzuálne sekvencie dobre súhlasili s predchádzajúcimi zisteniami o expanziách opakovaní GGC.Okrem toho boli repetície {(GGA)n (GGC)n}n identifikované ako potenciálny genetický marker fenotypu s dominantnou slabosťou (obrázok 2).
Obrázok 1. Expanzia opakovania spojená s ochorením identifikovaná na exóne 1 izoforiem NOTCH2NLC.
Obrázok 2. Konsenzuálne sekvencie opakovania NPTCH2NLC u pacientov s NIID s (*) alebo bez fenotypu s dominanciou slabosti
NGény OTCH2NL sú gény špecifické pre človeka, o ktorých sa predpokladá, že zohrávajú dôležitú úlohu pri vývoji ľudského mozgu a neurologických ochoreniach.Avšak tri gény súvisiace s NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB a NOTCH2NLC) s > 99,1 % sekvenčnou identitou neboli vyriešené až do posledného zostavenia ľudského genómu.Sekvenovanie bez syntézy a dlhé čítanie na platforme nanopórov ukázalo pozoruhodné výhody pri riešení oblastí s vysokou podobnosťou a opakovaniami (GGC)n so 100% bohatými na GC.
Opakované expanzie GGC v NOTCH2NLC
Tsekvenovanie ranscriptomu bolo spracované na 2 postihnutých a 2 nepostihnutých členoch.Normalizovaná hĺbka čítania bola vypočítaná na sense a antisense vláknach v upstream od prvých exónov NOTCH2NL paralógov.Abnormálne anti-sense transkripty sa našli iba v postihnutých prípadoch, ktoré sa nachádzajú na začiatku alebo vo vnútri oblasti expanzie opakovania (fialové vrcholy v F1-14 a F1-16 na obrázku 3).Okrem toho bolo identifikovaných 54 stupňov a všetky boli obohatené o termíny GO a MPO súvisiace s neurónovými funkciami.
Obrázok 3. Normalizovaná hĺbka čítania na upstream od prvého exónu NOTCH2NLC v neovplyvnených (vyššie) a ovplyvnených (nižšie) prípadoch.
Technológia
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanopore sekvenovanie sa odlišuje od iných sekvenčných platforiem tým, že nukleotidy sa čítajú priamo bez procesu syntézy DNA.Keď jednovláknová DNA prechádza cez nanopórový proteínový pór (nanopór), rôzne nukleotidy generujú rôzne iónové prúdy, ktoré je možné zachytiť a preniesť do sekvencie báz.Samotná sekvenčná platforma ONT nevykazuje zjavné technické obmedzenie dĺžky čítania DNA.Preto sú k dispozícii ultra dlhé čítania (ULR) na zostavenie genómu vysokej kvality.Navyše tieto extrémne dlhé čítania, ktoré sú dostatočne dlhé na to, aby prekročili zložité sekvenčné prvky alebo štrukturálne variácie, pomáhajú prekonať obmedzenia krátkeho sekvenovania.
Sekvenovanie nanopórov
Identifikácia variácie štruktúry (SV).
Ssekvenovanie bez syntézy do značnej miery zachovalo informácie o metylácii DNA na templáte.Metylované A, T, C a G generujú odlišné iónové prúdy od nemetylovaných, ktoré je možné čítať priamo na platforme.Sekvenovanie nanopórov umožňuje profilovanie celého genómu 5 mC aj 6 mA pri rozlíšení jedného nukleotidu.
Odkaz
Jun Sone a kol.al.Sekvenovanie s dlhým čítaním identifikuje expanzie opakovania GGC v NOTCH2NLC spojené s ochorením intranukleárnej inklúzie neurónov.Prírodná genetika (2019)
Tech and Highlights sa zameriava na zdieľanie najnovších úspešných aplikácií rôznych vysokovýkonných sekvenčných technológií v rôznych oblastiach výskumu, ako aj skvelých nápadov v experimentálnom dizajne a dolovaní údajov.
Čas odoslania: Jan-06-2022