АДАМ ГЕНОМИКАСЫ
табиғат генетикасы
Ұзақ оқылатын реттілік нейрондық интрануклеарлы инклюзия ауруымен байланысты NOTCH2NLC-де GGC қайталану кеңеюін анықтайды.
ONT қайта секвенирлеу |Illumina |Тұтас экзома секвенциясы |CRISPR-Cas9 ONT мақсатты реттілік |RNA-seq |ONT 5mC метилдену шақыруы
Маңызды жерлер
1. Үлкен NIID отбасындағы байланысты талдау арқылы екі байланысты аймақ анықталды.
2.ONT негізіндегі ұзақ оқылатын секвенирлеу және Cas-9 делдалымен байыту ONT секвенциясы NOTCH2NLC 5′ UTR-де NIID, GGC қайталанатын кеңейтулердің ықтимал генетикалық себебін ашты.Бұл зерттеу сегменттік қайталанулар арқылы дамыған адамға тән гендердегі қайталанатын кеңейтулер туралы хабарлады.
3.РНҚ реттілігі NOTCH2NLC ішіндегі GGC қайталанатын кеңейту аймақтарының басында немесе ішінде аномальды антисенс транскрипттерін анықтады.
Фон
NЕуропалық ядроішілік инклюзия ауруы (НИИД) – орталық және шеткергі жүйке жүйелерінде эозинофильді гиалинді ядроішілік қосындылардың болуымен сипатталатын үдемелі және өліммен аяқталатын нейродегенеративті ауру.Оның өте өзгермелі клиникалық көріністері тері биопсиясы енгізілгенге дейін диагностикада үлкен қиындықтар туғызады.Дегенмен, гистопатологияға негізделген әдістер әлі де қате диагноздан зардап шегеді, бұл NIID-ті генетикалық түсінуді талап етеді.
Жетістіктер
Байланысты талдау
SHort-read секвенциясы негізінде тұтас геномды секвенирлеу (WGS) және толық экзомалық секвенирлеу (WES) үлкен NIID отбасында (13 зардап шеккен және 7 әсер етпеген мүше) орындалды.Осы деректерден алынған SNP бойынша байланыс талдауы тек екі байланысты аймақты көрсетті: 1p36.31-p36.22 кезінде 3,5 Мб аймақ (максималды LOD=2,32) және 1p22,1-q21,3 кезінде 58,1 Мб аймақ (максималды LOD: 4,21) ).Дегенмен, осы байланысқан аймақтарда патогенді SNP немесе CNV анықталмады.
NOTCH2NLC ішіндегі GGC кеңейтімдерін қайталау
Nанопор негізіндегі реттілік 8 отбасының 13 зардап шеккен және 4 әсер етпеген мүшесінде өңделді (басқа зардап шеккен мүше Pacbio ұзақ оқу реттілігі платформасы арқылы реттелген.).Ұзақ оқылған деректер 58,1 Мб байланысқан аймаққа NOTCH2NLC генінің 5′ UTR картасында аурумен байланысты GGC қайталану кеңеюін анықтады (1-сурет).Бұл қайталанатын кеңейтулер RP-PCR арқылы сыналған барлық 40 спорадикалық NIID жағдайында анықталды.
CNOTCH2NLC қайталауында (100 X-1,795 X) жоғары оқу қамтуына қол жеткізу үшін нанокеру платформасында as-9 делдалдық мақсатты реттілік қолданылды.Бұл консенсус тізбегі GGC қайталанатын кеңейтулер туралы алдыңғы нәтижелермен жақсы үйлеседі.Сонымен қатар, {(GGA)n (GGC)n}n қайталануы әлсіздік басым фенотип үшін әлеуетті генетикалық маркер ретінде анықталды (2-сурет).
Сурет 1. NOTCH2NLC изоформаларының 1 экзонында анықталған аурумен байланысты қайталанатын кеңею.
Сурет 2. NPTCH2NLC консенсус тізбегі (*) немесе әлсіздік басым фенотипі жоқ NIID пациенттерінде қайталанады
NOTCH2NL гендер адам миының эволюциясында және неврологиялық ауруларда маңызды рөл атқарады деп есептелетін адамға тән гендер.Дегенмен, реттілік сәйкестігі > 99,1% болатын NOTCH2-ге қатысты үш ген (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB және NOTCH2NLC) адам геномының соңғы жиынтығына дейін шешілмеді.Нанокерек платформасында синтезсіз және ұзақ оқылатын секвенирлеу 100% GC-қа бай жоғары ұқсастық пен (GGC)n қайталанатын аймақтарды шешуде елеулі артықшылықтарды көрсетті.
NOTCH2NLC ішіндегі GGC кеңейтімдерін қайталау
Tранскриптом секвенциясы 2 зардап шеккен және 2 әсер етпеген мүшеде өңделді.Нормаланған оқу тереңдігі NOTCH2NL паралогтарының бірінші экзондарының жоғары ағынындағы мағыналық және антисенстік жолдар бойынша есептелді.Аномальды сезімге қарсы транскрипттер тек қайталанатын кеңейту аймағының басында немесе ішінде орналасқан зардап шеккен жағдайларда ғана табылды (3-суреттегі F1-14 және F1-16-дағы күлгін шыңдар).Сонымен қатар, 54 DEG анықталды және барлығы нейрондық функцияларға қатысты GO және MPO терминдерімен байытылды.
Сурет 3. Әсер етпеген (жоғарыда) және әсер еткен (төменде) жағдайларда NOTCH2NLC бірінші экзонының жоғары ағынындағы нормаланған оқу тереңдігі.
Технология
Oxford Nanopore Technologies (ONT)
NАнопорлық секвенирлеудің басқа секвенирлеу платформаларынан ерекшелігі - нуклеотидтер ДНҚ синтезі процесінсіз тікелей оқылады.Бір тізбекті ДНҚ наноөлшемді протеин кеуегінен (нанопора) өткенде, әртүрлі нуклеотидтер әртүрлі иондық токтарды тудырады, оларды ұстап алуға және негіздердің тізбегіне ауыстыруға болады.ONT секвенирлеу платформасының өзі ДНҚ оқу ұзақтығының айқын техникалық шегін көрсетпейді.Сондықтан жоғары сапалы геномды жинақтау үшін ультра ұзақ оқулар (ULR) қол жетімді.Сонымен қатар, күрделі реттілік мүмкіндіктерін немесе құрылымдық вариацияны кесіп өту үшін жеткілікті ұзақ болатын бұл өте ұзақ оқулар мұнда қысқа оқу реттілігінің шектеулерін жеңуге көмектеседі.
Нанокесектік секвенирлеу
Құрылымдық вариацияны (SV) сәйкестендіру
SСинтезсіз секвенирлеу үлгідегі ДНҚ метилденуі туралы ақпаратты негізінен сақтады.Метилденген A, T, C және G платформадан тікелей оқуға болатын метилденбегендерден ерекше иондық токтарды тудырады.Нанопора секвенциясы бір нуклеотидтік рұқсатта 5 мК және 6 мА толық геномды профильдеуге мүмкіндік береді.
Анықтама
Джун Соне және т.ал.Ұзақ оқылатын реттілік нейрондық интрануклеарлы инклюзия ауруымен байланысты NOTCH2NLC-де GGC қайталану кеңеюін анықтайды.Табиғат генетикасы (2019)
Tech and Highlights әртүрлі зерттеулер аренасында әр түрлі жоғары өнімді секвенирлеу технологияларының ең соңғы сәтті қолданылуын, сондай-ақ тәжірибелік дизайн мен деректерді өндірудегі тамаша идеялармен бөлісуді мақсат етеді.
Жіберу уақыты: 06 қаңтар 2022 ж