ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΓΟΝΙΔΩΜΑΤΙΚΗ
γενετική της φύσης
Η αλληλουχία μακράς ανάγνωσης προσδιορίζει επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις GGC στο NOTCH2NLC που σχετίζονται με νευρωνική ενδοπυρηνική έγκλειση
ONT resequencing |Illumina |Ολόκληρη αλληλουχία εξωμάτων |CRISPR-Cas9 ONT στοχευμένη αλληλουχία |RNA-seq |ONT κλήση μεθυλίωσης 5 mC
Καλύτερες στιγμές
1.Με ανάλυση σύνδεσης σε μια μεγάλη οικογένεια NIID, εντοπίστηκαν δύο συνδεδεμένες περιοχές.
Η αλληλουχία μακράς ανάγνωσης που βασίζεται σε 2.ONT και η αλληλουχία ΟΝΤ εμπλουτισμού με τη μεσολάβηση Cas-9 ανακάλυψαν μια πιθανή γενετική αιτία επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων NIID, GGC σε 5' UTR του NOTCH2NLC.Αυτή η μελέτη ανέφερε επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις σε ειδικά για τον άνθρωπο γονίδια για πρώτη φορά που εξελίχθηκαν μέσω τμηματικών διπλασιασμών.
Η αλληλουχία 3.RNA αποκάλυψε ανώμαλα αντιπληροφοριακά μεταγραφήματα στην αρχή ή εντός των περιοχών επέκτασης επανάληψης GGC στο NOTCH2NLC.
Ιστορικό
NΗ νόσος της ευρωενικής ενδοπυρηνικής ένταξης (NIID) είναι μια προοδευτική και θανατηφόρα νευροεκφυλιστική νόσος, η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία ηωσινοφιλικών υαλικών ενδοπυρηνικών εγκλεισμάτων στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα.Οι εξαιρετικά μεταβλητές κλινικές του εκδηλώσεις δημιουργούν μεγάλες δυσκολίες στη διάγνωση μέχρι την εισαγωγή της βιοψίας δέρματος.Ωστόσο, οι μέθοδοι που βασίζονται στην ιστοπαθολογία εξακολουθούν να υποφέρουν από λανθασμένη διάγνωση, η οποία απαιτεί μια γενετική κατανόηση του NIID.
Επιτεύγματα
Ανάλυση Σύνδεσης
SΗ αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) και η αλληλουχία ολόκληρου του εξώματος (WES) με βάση την αλληλουχία hort-read πραγματοποιήθηκε σε μια μεγάλη οικογένεια NIID (13 προσβεβλημένα και 7 μη προσβεβλημένα μέλη).Η ανάλυση σύνδεσης σε SNP που εξήχθησαν από αυτά τα δεδομένα αποκάλυψε μόνο δύο συνδεδεμένες περιοχές: μια περιοχή 3,5 Mb στο 1p36,31-p36,22 (μέγιστο LOD=2,32) και μια περιοχή 58,1 Mb στο 1p22,1-q21,3 (μέγιστο LOD: 4,21 ).Ωστόσο, δεν εντοπίστηκαν παθογόνα SNP ή CNV σε αυτές τις συνδεδεμένες περιοχές.
Επαναλάβετε τις επεκτάσεις GGC στο NOTCH2NLC
NΗ αλληλουχία βασισμένη σε ανώπορα υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε 13 προσβεβλημένα και 4 μη προσβεβλημένα μέλη από 8 οικογένειες (ένα άλλο προσβεβλημένο μέλος αλληλουχήθηκε από την πλατφόρμα μακράς αλληλουχίας ανάγνωσης Pacbio.).Δεδομένα μακροχρόνιας ανάγνωσης αποκάλυψαν επεκτάσεις επαναλαμβανόμενων GGC που σχετίζονται με νόσο στο 5' UTR της χαρτογράφησης γονιδίου NOTCH2NLC σε συνδεδεμένη περιοχή 58,1 Mb (Εικόνα 1).Αυτές οι επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις ταυτοποιήθηκαν επίσης και στις 40 σποραδικές περιπτώσεις NIID που δοκιμάστηκαν με RP-PCR.
CΗ αλληλουχία στόχου με τη μεσολάβηση as-9 σε πλατφόρμα νανοπόρου χρησιμοποιήθηκε για την επίτευξη υψηλότερης κάλυψης ανάγνωσης στην επανάληψη NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).Αυτές οι συναινετικές αλληλουχίες συμφωνούσαν καλά με προηγούμενα ευρήματα σχετικά με τις επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις GGC.Επιπλέον, οι επαναλήψεις {(GGA)n (GGC)n}n ταυτοποιήθηκαν ως πιθανός γενετικός δείκτης για τον κυρίαρχο σε αδυναμία φαινότυπο (Εικόνα 2).
Σχήμα 1. Επαναληπτική επέκταση σχετιζόμενη με ασθένεια που ταυτοποιήθηκε στο εξόνιο 1 των ισομορφών NOTCH2NLC.
Σχήμα 2. Οι συναινετικές αλληλουχίες του NPTCH2NLC επαναλαμβάνονται σε ασθενείς με NIID με (*) ή χωρίς φαινότυπο που κυριαρχεί σε αδυναμία
NΤα γονίδια OTCH2NL είναι γονίδια ειδικά για τον άνθρωπο, τα οποία πιστεύεται ότι παίζουν ζωτικό ρόλο στην εξέλιξη του ανθρώπινου εγκεφάλου και στις νευρολογικές ασθένειες.Ωστόσο, τρία γονίδια που σχετίζονται με το NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB και NOTCH2NLC) με >99,1% ταυτότητα αλληλουχίας δεν επιλύθηκαν μέχρι την τελευταία συγκρότηση ανθρώπινου γονιδιώματος.Η αλληλουχία χωρίς σύνθεση και μακροχρόνια ανάγνωση σε πλατφόρμα νανοπόρων έχουν δείξει αξιοσημείωτα πλεονεκτήματα στην επίλυση περιοχών υψηλής ομοιότητας και επαναλήψεων (GGC)n με 100% πλούσιες σε GC.
Επαναλάβετε τις επεκτάσεις GGC στο NOTCH2NLC
TΗ αλληλουχία ranscriptome υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε 2 προσβεβλημένα και 2 μη προσβεβλημένα μέλη.Το κανονικοποιημένο βάθος ανάγνωσης υπολογίστηκε σε λογικούς και αντιπληροφοριακούς κλώνους στα ανάντη των πρώτων εξονίων των παραλόγων NOTCH2NL.Ανώμαλες αντινοηματικές μεταγραφές βρέθηκαν μόνο σε προσβεβλημένες περιπτώσεις, οι οποίες βρίσκονται στην αρχή ή μέσα στην επαναλαμβανόμενη περιοχή επέκτασης (Μωβ κορυφές στο F1-14 και F1-16 στο Σχήμα 3.).Επιπλέον, εντοπίστηκαν 54 DEG και όλα εμπλουτίστηκαν με όρους GO και MPO που σχετίζονται με νευρωνικές λειτουργίες.
Εικόνα 3. Κανονικοποιημένο βάθος ανάγνωσης στο ανάντη του πρώτου εξονίου του NOTCH2NLC σε μη επηρεασμένες (παραπάνω) και επηρεασμένες (κάτω) περιπτώσεις.
Τεχνολογία
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NΗ αλληλουχία ανοπόρων διακρίνεται από άλλες πλατφόρμες προσδιορισμού αλληλουχίας, στο ότι τα νουκλεοτίδια διαβάζονται απευθείας χωρίς διαδικασία σύνθεσης DNA.Καθώς ένας μονόκλωνος DNA διέρχεται από έναν πόρο πρωτεΐνης νανο-μεγέθους (νανοπόρος), διαφορετικά νουκλεοτίδια δημιουργούν διαφορετικά ιοντικά ρεύματα, τα οποία μπορούν να συλληφθούν και να μεταφερθούν σε αλληλουχία βάσεων.Η ίδια η πλατφόρμα αλληλουχίας ONT δεν εμφανίζει προφανές τεχνικό όριο στη διάρκεια της ανάγνωσης του DNA.Ως εκ τούτου, οι υπερμακρές αναγνώσεις (ULR) είναι διαθέσιμες για συγκρότηση γονιδιώματος υψηλής ποιότητας.Επιπλέον, αυτές οι εξαιρετικά μεγάλες αναγνώσεις, οι οποίες είναι αρκετά μεγάλες για να διασταυρωθούν σύνθετα χαρακτηριστικά ακολουθίας ή δομικές παραλλαγές, βοηθούν να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της αλληλουχίας σύντομης ανάγνωσης εδώ.
Αλληλουχία νανοπόρων
Προσδιορισμός παραλλαγής δομής (SV).
SΗ αλληλουχία χωρίς σύνθεση διατήρησε σε μεγάλο βαθμό τις πληροφορίες μεθυλίωσης του DNA στο πρότυπο.Τα μεθυλιωμένα A, T, C και G δημιουργούν διαφορετικά ιοντικά ρεύματα από τα μη μεθυλιωμένα, τα οποία μπορούν να διαβαστούν απευθείας από την πλατφόρμα.Ο προσδιορισμός αλληλουχίας νανοπόρων ενισχύει το προφίλ ολόκληρου του γονιδιώματος τόσο 5mC όσο και 6mA σε ανάλυση ενός νουκλεοτιδίου.
Αναφορά
Jun Sone, et.al.Η αλληλουχία μακράς ανάγνωσης προσδιορίζει τις επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις GGC στο NOTCH2NLC που σχετίζονται με τη νευρωνική ενδοπυρηνική έγκλειση.Nature Genetics (2019)
Tech and Highlights στοχεύει στην κοινή χρήση των πιο πρόσφατων επιτυχημένων εφαρμογών διαφορετικών τεχνολογιών αλληλουχίας υψηλής απόδοσης σε διάφορους τομείς έρευνας καθώς και λαμπρών ιδεών στον πειραματικό σχεδιασμό και την εξόρυξη δεδομένων.
Ώρα δημοσίευσης: Ιαν-06-2022