EMBERI GENOMIKA
természetgenetika
A hosszan leolvasott szekvenálás azonosítja a GGC ismétlődő expanzióit a NOTCH2NLC-ben, amely a neuronális intranukleáris zárványos betegséghez kapcsolódik
ONT újrasorolás |Illumina |Teljes exome szekvenálás |CRISPR-Cas9 ONT célzott szekvenálás |RNS-seq |ONT 5mC metilációs hívás
Kiemelések
1. Egy nagy NIID családon végzett kapcsolódási elemzéssel két kapcsolt régiót azonosítottunk.
2.ONT-alapú, hosszan leolvasható szekvenálás és Cas-9 által közvetített dúsítás Az ONT szekvenálás a NOTCH2NLC 5′ UTR-ében a NIID, GGC ismétlődések lehetséges genetikai okát fedezte fel.Ez a tanulmány első alkalommal számolt be az emberspecifikus gének ismétlődő expanzióiról, amelyek szegmentális megkettőződések révén fejlődtek ki.
3. Az RNS szekvenálás abnormális antiszensz transzkriptumot tárt fel a NOTCH2NLC GGC ismétlődő expanziós régióiban vagy azok belsejében.
Háttér
NAz euronal intranuclear inclusion disease (NIID) egy progresszív és végzetes neurodegeneratív betegség, amelyet eozinofil hialin intranukleáris zárványok jelenléte jellemez a központi és perifériás idegrendszerben.Rendkívül változó klinikai megnyilvánulásai nagy nehézségeket okoznak a diagnózisban egészen a bőrbiopszia bevezetéséig.A kórszövettani alapú módszerek azonban továbbra is téves diagnózisoktól szenvednek, ami az NIID genetikai megértését teszi szükségessé.
Eredmények
Kapcsolódási elemzés
Short-read szekvenáláson alapuló teljes genom szekvenálást (WGS) és teljes exome szekvenálást (WES) végeztek egy nagy NIID családon (13 érintett és 7 nem érintett tag).Az ezekből az adatokból kinyert SNP-ken végzett kapcsolódási elemzés csak két kapcsolt régiót mutatott ki: egy 3,5 Mb-os régiót az 1p36,31-p36,22-nél (maximális LOD=2,32) és egy 58,1 Mb-os régiót az 1p22,1-q21,3-nál (maximális LOD: 4,21). ).Ezekben a kapcsolt régiókban azonban nem azonosítottak patogén SNP-ket vagy CNV-ket.
GGC ismétlődő bővítések a NOTCH2NLC-ben
NAz anopórus alapú szekvenálást 13 érintett és 4 érintetlen tagon dolgoztuk fel 8 családból (egy másik érintett tagot a Pacbio long read szekvenálási platform szekvenáltuk).A régóta olvasott adatok betegséggel összefüggő GGC-ismétlődést tártak fel a NOTCH2NLC gén 5′ UTR-ében, amely 58,1 Mb-os kapcsolt régióhoz rendelődik (1. ábra).Ezeket az ismétlődő expanziókat mind a 40 sporadikus NIID-esetben azonosították, amelyeket RP-PCR-rel teszteltek.
CA nanopórusos platformon as-9 által közvetített célszekvenálást alkalmaztunk a nagyobb lefedettség elérése érdekében a NOTCH2NLC ismétlésen (100 X-1795 X).Ezek a konszenzusos szekvenciák jól egyeztek a GGC ismétlődő kiterjesztésével kapcsolatos korábbi eredményekkel.Ezenkívül a {(GGA)n (GGC)n}n ismétlődést a gyengeség-domináns fenotípus potenciális genetikai markereként azonosították (2. ábra).
1. ábra: A NOTCH2NLC izoformák 1. exonján azonosított betegséggel összefüggő ismétlődő expanzió.
2. ábra: Az NPTCH2NLC ismétlődésének konszenzus szekvenciája gyengeség-domináns fenotípusú (*) vagy anélküli NIID betegekben
NAz OTCH2NL gének emberspecifikus gének, amelyekről úgy tartják, hogy létfontosságú szerepet játszanak az emberi agy evolúciójában és neurológiai betegségekben.Azonban három, a NOTCH2-vel rokon gént (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB és NOTCH2NLC) több mint 99,1%-os szekvencia-azonossággal nem sikerült feloldani a legutóbbi humán genom összeállításig.A nanopórusos platformon végzett szintézismentes és hosszan leolvasható szekvenálás jelentős előnyöket mutatott a nagy hasonlóságú régiók és a (GGC)n ismétlődések 100%-ban GC-ben gazdag feloldásában.
GGC ismétlődő bővítések a NOTCH2NLC-ben
TA ranscriptome szekvenálást 2 érintett és 2 nem érintett tagon dolgoztuk fel.A normalizált olvasási mélységet a NOTCH2NL paralógok első exonjai előtti szensz és antiszensz szálakon számítottuk ki.Abnormális antiszensz transzkriptumot csak az ismétlődő expanziós régió elején vagy belsejében lévő érintett esetekben találtunk (lila csúcsok az F1-14-ben és az F1-16-ban a 3. ábrán).Ezenkívül 54 DEG-t azonosítottak, és mindegyiket feldúsították a neuronális funkciókkal kapcsolatos GO és MPO kifejezésekkel.
3. ábra: Normalizált olvasási mélység a NOTCH2NLC első exonja előtt, nem érintett (fent) és érintett (lent) esetekben.
Technológia
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NAz anopórus szekvenálás abban különbözik a többi szekvenálási platformtól, hogy a nukleotidokat közvetlenül, DNS-szintézis nélkül olvassák le.Amint egyszálú DNS áthalad egy nanoméretű fehérjepóruson (nanopóruson), a különböző nukleotidok különböző ionáramokat generálnak, amelyek megragadhatók és bázisok szekvenciájába vihetők át.Maga az ONT szekvenáló platform nem mutat nyilvánvaló technikai korlátot a DNS-olvasás hosszában.Ezért az Ultra-long reads (ULR) elérhető a genom kiváló minőségű összeállításához.Ezen túlmenően, ezek a rendkívül hosszú leolvasások, amelyek elég hosszúak ahhoz, hogy átlépjék az összetett szekvencia jellemzőit vagy szerkezeti variációit, segítenek leküzdeni a rövid olvasási szekvenálás korlátait.
Nanopórus szekvenálás
Struktúra variáció (SV) azonosítás
SA szintézismentes szekvenálás nagyrészt megőrizte a DNS-metilációs információkat a templáton.A metilált A, T, C és G eltérő ionáramot hoz létre a nem metilezettektől, amelyeket a platform közvetlenül leolvashat.A nanopórusos szekvenálás lehetővé teszi az 5 mC és 6 mA teljes genom profilalkotását egyetlen nukleotid felbontás mellett.
Referencia
Jun Sone et.al.A hosszan leolvasott szekvenálás azonosítja a GGC ismétlődő expanzióit a NOTCH2NLC-ben, amely a neuronális intranukleáris zárványos betegséghez kapcsolódik.Természetgenetika (2019)
Technika és kiemelések célja a különböző nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák legfrissebb sikeres alkalmazásainak megosztása a különböző kutatási színtereken, valamint a briliáns ötletek a kísérleti tervezés és adatbányászat terén.
Feladás időpontja: 2022-06-06