ヒトゲノミクス
自然遺伝学
ロングリードシーケンスにより、神経核内封入体疾患に関連する NOTCH2NLC における GGC リピート拡張が特定される
ONT の再シーケンス |イルミナ |全エクソームシーケンス |CRISPR-Cas9 ONT 標的配列決定 |RNA配列 |ONT 5mC メチル化呼び出し
ハイライト
1.大規模なNIIDファミリーの連鎖解析により、2つの連鎖領域が同定された。
2.ONTベースのロングリードシーケンスとCas-9媒介濃縮 ONTシーケンスにより、NOTCH2NLCの5'UTRにおけるNIID、GGCリピート拡張の潜在的な遺伝的原因が発見されました。この研究は、分節重複を通じて進化したヒト特異的遺伝子のリピート拡張を初めて報告した。
3.RNA配列決定により、NOTCH2NLCのGGCリピート拡張領域の先頭または内部に異常なアンチセンス転写物が存在することが明らかになりました。
背景
Nユーロ核内封入体病 (NIID) は進行性かつ致死的な神経変性疾患であり、中枢神経系および末梢神経系における好酸球性ヒアリン核内封入体の存在を特徴とします。その臨床症状は非常に多様であるため、皮膚生検が導入されるまで診断が非常に困難になります。しかし、組織病理学に基づく方法では依然として誤診が発生しており、NIIDの遺伝的理解が求められています。
業績
連鎖分析
Sホートリードシーケンスに基づく全ゲノムシーケンス（WGS）および全エクソームシーケンス（WES）が、大規模なNIIDファミリー（13人の罹患メンバーと7人の非罹患メンバー）に対して実施されました。これらのデータから抽出された SNP の連鎖解析により、連鎖領域は 2 つだけであることが明らかになりました。1p36.31-p36.22 の 3.5 Mb 領域 (最大 LOD=2.32) と 1p22.1-q21.3 の 58.1 Mb 領域 (最大 LOD: 4.21) ）。ただし、これらの関連領域では病原性 SNP または CNV は同定されませんでした。
NOTCH2NLC での GGC リピート展開
Nアノポアベースのシーケンスは、8 家族からの 13 人の罹患メンバーと 4 人の非罹患メンバーに対して処理されました (別の罹患メンバーは、Pacbio ロングリード シーケンス プラットフォームによってシーケンスされました)。ロングリードデータにより、NOTCH2NLC 遺伝子の 5' UTR における疾患に関連した GGC リピート拡張が 58.1 Mb の連結領域にマッピングされていることが明らかになりました (図 1)。これらのリピート拡大は、RP-PCR で検査した 40 件の散発性 NIID 症例すべてでも確認されました。
Cナノポアプラットフォーム上の as-9 媒介ターゲットシークエンシングを採用して、NOTCH2NLC リピート (100 X ～ 1,795 X) でより高い読み取り範囲を達成しました。これらのコンセンサス配列は、GGC リピート拡張に関する以前の発見とよく一致しました。さらに、{(GGA)n (GGC)n}n リピートが、筋力低下優勢表現型の潜在的な遺伝マーカーとして同定されました (図 2)。
図 1. NOTCH2NLC アイソフォームのエクソン 1 で特定された疾患に関連したリピート拡張。
図 2. 脱力優勢表現型を持つ (*) または持たない NIID 患者における NPTCH2NLC リピートのコンセンサス配列
NOTCH2NL 遺伝子はヒト特異的遺伝子であり、ヒトの脳の進化と神経疾患に重要な役割を果たしていると考えられています。しかし、99.1% を超える配列同一性を持つ 3 つの NOTCH2 関連遺伝子 (NOTCH2NLA、NOTCH2NLB、NOTCH2NLC) は、最新のヒトゲノム構築まで解明されませんでした。ナノポアプラットフォームでの合成不要のロングリードシーケンスは、類似性の高い領域や 100% GC リッチの (GGC)n リピートの解決において顕著な利点を示しています。
NOTCH2NLC での GGC リピート展開
Tランスクリプトーム配列決定は、影響を受けたメンバー 2 名と影響を受けていないメンバー 2 名に対して処理されました。正規化された読み取り深度は、NOTCH2NL パラログの最初のエクソンの上流にあるセンス鎖とアンチセンス鎖で計算されました。異常なアンチセンス転写物は、リピート拡張領域の先頭または内側に位置する罹患症例でのみ見つかりました (図 3 の F1-14 および F1-16 の紫色のピーク)。さらに、54 個の DEG が特定され、そのすべてに神経機能に関連する GO および MPO 用語が豊富でした。
図 3. 影響を受けていないケース (上) と影響を受けたケース (下) における NOTCH2NLC の最初のエクソンの上流の正規化されたリード深度。
テクノロジー
オックスフォード ナノポア テクノロジーズ (ONT)
Nアノポアシーケンシングは、ヌクレオチドが DNA 合成プロセスを経ずに直接読み取られるという点で、他のシーケンシングプラットフォームとは異なります。一本鎖 DNA がナノサイズのタンパク質の細孔 (ナノポア) を通過すると、異なるヌクレオチドが異なるイオン流を生成し、これを捕捉して塩基の配列に移すことができます。ONT シーケンス プラットフォーム自体には、DNA 読み取りの長さに関する明らかな技術的制限はありません。したがって、超ロングリード (ULR) を使用して高品質のゲノムアセンブリを行うことができます。さらに、これらの非常に長いリードは、複雑な配列の特徴や構造的変異を横断するのに十分な長さであり、ここでのショートリードシーケンシングの限界を克服するのに役立ちます。
ナノポア配列決定
構造変異 (SV) の特定
S合成不要のシークエンシングでは、鋳型上の DNA メチル化情報がほとんど保存されていました。メチル化された A、T、C、および G は、非メチル化のものとは異なるイオン電流を生成し、プラットフォームで直接読み取ることができます。ナノポア シーケンシングにより、5mC と 6mA の両方の全ゲノム プロファイリングを単一ヌクレオチドの解像度で行うことができます。
参照
曽根純 ほかアル。ロングリードシークエンシングにより、神経核内封入体疾患に関連する NOTCH2NLC における GGC リピート拡張が特定されます。自然遺伝学 (2019)
技術とハイライト は、実験計画やデータマイニングにおける素晴らしいアイデアだけでなく、さまざまな研究分野におけるさまざまなハイスループットシーケンス技術の最新の成功した応用を共有することを目的としています。
投稿時刻: 2022 年 1 月 6 日