LIDSKÁ GENOMIKA
přírodní genetika
Sekvenování s dlouhým čtením identifikuje expanze repetice GGC v NOTCH2NLC spojené s neuronální intranukleární inkluzí
ONT resekvenování |Illumina |Sekvenování celého exomu |CRISPR-Cas9 ONT cílené sekvenování |RNA-sekv |ONT 5mC methylační volání
Zvýraznění
1. Analýzou vazby na velké rodině NIID byly identifikovány dvě spojené oblasti.
2. Long-read sekvenování založené na ONT a Cas-9 zprostředkované obohacení ONT sekvenování objevilo potenciální genetickou příčinu NIID, expanze repetice GGC v 5′ UTR NOTCH2NLC.Tato studie poprvé zaznamenala opakované expanze lidských specifických genů, které se vyvinuly prostřednictvím segmentových duplikací.
3. Sekvenování RNA odhalilo abnormální antisense transkripty na začátku nebo uvnitř oblastí expanze repetice GGC v NOTCH2NLC.
Pozadí
Neuronal intranuclear inclusion disease (NIID) je progresivní a fatální neurodegenerativní onemocnění, které je charakterizováno přítomností eozinofilních hyalinních intranukleárních inkluzí v centrálním a periferním nervovém systému.Jeho vysoce variabilní klinické projevy způsobují velké obtíže v diagnostice až do zavedení kožní biopsie.Metody založené na histopatologii však stále trpí chybnou diagnózou, která vyžaduje genetické pochopení NIID.
Úspěchy
Analýza vazeb
SHort-read sekvenování založené na sekvenování celého genomu (WGS) a sekvenování celého exomu (WES) bylo provedeno na velké rodině NIID (13 postižených a 7 nepostižených členů).Analýza vazeb na SNP extrahovaných z těchto dat odhalila pouze dvě spojené oblasti: oblast 3,5 Mb na 1p36.31-p36.22 (maximální LOD=2,32) a 58,1 Mb oblast na 1p22.1-q21.3 (maximální LOD: 4,21 ).V těchto spojených oblastech však nebyly identifikovány žádné patogenní SNP nebo CNV.
Opakovaná rozšíření GGC v NOTCH2NLC
NSekvenování založené na anopore bylo zpracováno na 13 postižených a 4 nepostižených členech z 8 rodin (další postižený člen byl sekvenován pomocí sekvenační platformy pro dlouhé čtení Pacbio.).Dlouho přečtená data odhalila expanze repetice GGC spojené s onemocněním v 5′ UTR mapování genu NOTCH2NLC do oblasti spojené s 58,1 Mb (obrázek 1).Tyto opakované expanze byly také identifikovány ve všech 40 sporadických případech NIID testovaných pomocí RP-PCR.
CCílové sekvenování zprostředkované as-9 na nanopórové platformě bylo použito k dosažení vyššího pokrytí čtením na NOTCH2NLC repetici (100 X-1 795 X).Tyto konsenzuální sekvence dobře souhlasily s předchozími zjištěními o expanzích repetice GGC.Navíc byly identifikovány repetice {(GGA)n (GGC)n}n jako potenciální genetický marker fenotypu s dominantní slabostí (obrázek 2).
Obrázek 1. Expanze repetice související s onemocněním identifikovaná na exonu 1 izoforem NOTCH2NLC.
Obrázek 2. Konsenzuální sekvence opakování NPTCH2NLC u pacientů s NIID s (*) nebo bez fenotypu s dominantní slabostí
NGeny OTCH2NL jsou geny specifické pro člověka, o kterých se předpokládá, že hrají zásadní roli ve vývoji lidského mozku a neurologických onemocněních.Nicméně tři geny související s NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB a NOTCH2NLC) s >99,1% sekvenční identitou nebyly vyřešeny až do posledního sestavení lidského genomu.Sekvenování bez syntézy a dlouhé čtení na nanopórové platformě ukázalo pozoruhodné výhody v rozlišení oblastí s vysokou podobností a (GGC)n repeticemi se 100% GC bohatými.
Opakovaná rozšíření GGC v NOTCH2NLC
Tsekvenování ranscriptomu bylo zpracováno na 2 postižených a 2 nepostižených členech.Normalizovaná hloubka čtení byla vypočtena na sense a antisense vláknech v upstream od prvních exonů paralogů NOTCH2NL.Abnormální anti-sense transkripty byly nalezeny pouze u postižených případů, které se nacházejí na začátku nebo uvnitř oblasti expanze repetice (fialové píky v F1-14 a F1-16 na obrázku 3).Kromě toho bylo identifikováno 54 stupňů a všechny byly obohaceny o termíny GO a MPO související s neuronálními funkcemi.
Obrázek 3. Normalizovaná hloubka čtení na upstreamu od prvního exonu NOTCH2NLC v neovlivněných (výše) a ovlivněných (níže) případech.
Technika
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanopore sekvenování se odlišuje od jiných sekvenačních platforem tím, že nukleotidy jsou čteny přímo bez procesu syntézy DNA.Když jednovláknová DNA prochází proteinovým pórem o velikosti nano (nanopór), různé nukleotidy generují různé iontové proudy, které lze zachytit a přenést do sekvence bází.Samotná sekvenační platforma ONT nevykazuje zjevné technické omezení délky čtení DNA.Proto jsou pro sestavení genomu vysoké kvality k dispozici ultra dlouhá čtení (ULR).Navíc tato extrémně dlouhá čtení, která jsou dostatečně dlouhá na to, aby překonala složité sekvenční rysy nebo strukturální variace, zde pomáhají překonat omezení krátkého sekvenování.
Sekvenování nanopórů
Identifikace změny struktury (SV).
Ssekvenování bez syntézy do značné míry zachovalo informace o methylaci DNA na templátu.Methylované A, T, C a G generují odlišné iontové proudy od nemetylovaných, které lze číst přímo platformou.Sekvenování nanoporů umožňuje profilování celého genomu 5 mC i 6 mA při rozlišení jednoho nukleotidu.
Odkaz
Jun Sone, et.al.Sekvenování s dlouhým čtením identifikuje expanze repetice GGC u NOTCH2NLC spojené s neuronálním intranukleárním onemocněním inkluze.Přírodní genetika (2019)
Tech and Highlights si klade za cíl sdílet nejnovější úspěšnou aplikaci různých vysoce výkonných sekvenačních technologií v různých oblastech výzkumu a také skvělé nápady v experimentálním designu a dolování dat.
Čas odeslání: leden-06-2022