MENSLIKE GENOMIKA
natuurgenetika
Langleesvolgordebepaling identifiseer GGC-herhalingsuitbreidings in NOTCH2NLC wat verband hou met neuronale intranukleêre insluitingsiekte
ONT hervolgorde |Illumina |Hele eksoomvolgorde |CRISPR-Cas9 ONT geteikende volgordebepaling |RNA-volgens |ONT 5mC metilering roeping
Hoogtepunte
1.Deur Koppelingsanalise op 'n groot NIID-familie, is twee gekoppelde streke geïdentifiseer.
2.ONT-gebaseerde langleesvolgordebepaling en Cas-9-gemedieerde verryking ONT-volgordebepaling het 'n potensiële genetiese oorsaak van NIID, GGC-herhalingsuitbreidings in 5′ UTR van NOTCH2NLC ontdek.Hierdie studie het vir die eerste keer herhaalde uitbreidings in mensspesifieke gene gerapporteer wat deur segmentele duplisering ontwikkel het.
3.RNA-volgordebepaling het abnormale antisense-transkripsies in die begin of binne GGC-herhalingsuitbreidingsstreke in NOTCH2NLC geopenbaar.
Agtergrond
Neuronale intranukleêre insluitingsiekte (NIID) is 'n progressiewe en dodelike neurodegeneratiewe siekte, wat gekenmerk word deur die teenwoordigheid van eosinofiele hialien-intranukleêre insluitings in sentrale en perifere senuweestelsels.Sy hoogs veranderlike kliniese manifestasies veroorsaak groot probleme met diagnose tot die bekendstelling van velbiopsie.Histopatologie-gebaseerde metodes ly egter steeds aan verkeerde diagnose, wat 'n genetiese begrip van NIID vereis.
Prestasies
Koppelingsanalise
Short-lees volgordebepaling gebaseer heelgenoom volgordebepaling (WGS) en heel eksoom volgordebepaling (WES) is uitgevoer op 'n groot NIID familie (13 geaffekteerde en 7 onaangeraakte lede).Koppelingsanalise op SNP's wat uit hierdie data onttrek is, het slegs twee gekoppelde streke aan die lig gebring: 'n 3.5 Mb-streek by 1p36.31-p36.22 (maksimum LOD=2.32) en 'n 58.1 Mb-streek by 1p22.1-q21.3 (maksimum LOD: 4.21) ).Geen patogeniese SNP's of CNV's is egter in hierdie gekoppelde streke geïdentifiseer nie.
GGC herhaal uitbreidings in NOTCH2NLC
Nanopore-gebaseerde volgordebepaling is verwerk op 13 geaffekteerde en 4 onaangeraakte lede uit 8 gesinne (nog 'n geaffekteerde lid is deur Pacbio-langleesvolgordebepalingsplatform gerangskik.).Langleesdata het siektegeassosieerde GGC-herhalingsuitbreidings in die 5′ UTR van NOTCH2NLC geenkartering na 58.1 Mb gekoppelde streek aan die lig gebring (Figuur 1).Hierdie herhaalde uitbreidings is ook geïdentifiseer in al 40 sporadiese NIID-gevalle wat deur RP-PCR getoets is.
Cas-9-gemedieerde teikenvolgordebepaling op nanopore-platform is gebruik om hoër leesdekking op NOTCH2NLC-herhaling te bereik (100 X-1,795 X).Hierdie konsensusreekse het goed ooreengestem met vorige bevindings oor GGC-herhalingsuitbreidings.Boonop is {(GGA)n (GGC)n}n herhalings geïdentifiseer as 'n potensiële genetiese merker vir swakheid-dominante fenotipe (Figuur 2).
Figuur 1. Siekte-geassosieerde herhalende uitbreiding geïdentifiseer op ekson 1 van NOTCH2NLC isovorme.
Figuur 2. Konsensusvolgorde van NPTCH2NLC-herhaling in NIID-pasiënte met(*) of sonder swakheid-dominante fenotipe
NOTCH2NL-gene is mensspesifieke gene, wat vermoedelik 'n belangrike rol speel in menslike breinevolusie en neurologiese siektes.Drie NOTCH2-verwante gene (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB en NOTCH2NLC) met >99.1% volgorde-identiteit is egter nie opgelos tot die jongste menslike genoomsamestelling nie.Sintesevrye en langleesvolgordebepaling op nanopore-platform het noemenswaardige voordele getoon in die oplossing van streke met hoë ooreenkomste en (GGC)n-herhalings met 100% GC-ryk.
GGC herhaal uitbreidings in NOTCH2NLC
Transkriptoomvolgordebepaling is op 2 geaffekteerde en 2 onaangeraakte lede verwerk.Genormaliseerde leesdiepte is bereken op sin en antisense stringe stroomop van eerste eksons van NOTCH2NL paraloge.Abnormale anti-sin transkripsies is slegs gevind in aangetaste gevalle, wat in die begin of binne die herhalende uitbreidingsgebied sit (Pers pieke in F1-14 en F1-16 in Figuur 3.).Daarbenewens is 54 DEG's geïdentifiseer en almal is verryk in GO en MPO terme wat verband hou met neuronale funksies.
Figuur 3. Genormaliseerde leesdiepte stroomop van die eerste ekson van NOTCH2NLC in ongeaffekteerde (bo) en geaffekteerde (onder) gevalle.
Tegnologie
Oxford Nanopore Tegnologieë (ONT)
Nanopore volgordebepaling onderskei hom van ander volgordebepalingsplatforms, deurdat die nukleotiede direk gelees word sonder DNA-sinteseproses.Soos 'n enkelstreng-DNS deur 'n nano-grootte proteïenporie (nanoporie) beweeg, genereer verskillende nukleotiede verskillende ioniese strome, wat vasgevang en in volgorde van basisse oorgedra kan word.ONT-volgordebepalingsplatform self toon nie oënskynlike tegniese beperking op die lengte van DNA-lesing nie.Daarom is ultralang lees (ULR's) beskikbaar vir genoomsamestelling van hoë gehalte.Boonop help hierdie uiters lang leesstukke, wat lank genoeg is om komplekse volgordekenmerke of strukturele variasie oor te steek, die beperkings van kortleesvolgordebepaling hier te oorkom.
Nanopore-volgordebepaling
Struktuurvariasie (SV) identifikasie
Syntese-vrye volgordebepaling het grootliks bewaar DNA-metileringsinligting op sjabloon.Gemetileerde A, T, C en G genereer duidelike ioniese strome van ongemetileerde strome, wat direk deur die platform gelees kan word.Nanopore-volgordebepaling bemagtig heelgenoom-profilering van beide 5mC en 6mA by enkelnukleotiedresolusie.
Verwysing
Jun Sone, et.al.Langleesvolgordebepaling identifiseer GGC-herhalingsuitbreidings in NOTCH2NLC wat verband hou met neuronale intranukleêre insluitingsiekte.Nature Genetics (2019)
Tegnologie en hoogtepunte beoog om die mees onlangse suksesvolle toepassing van verskillende hoë-deurset-volgorde-tegnologieë in verskeie navorsingsarena te deel, asook briljante idees in eksperimentele ontwerp en data-ontginning.
Postyd: Jan-06-2022