Fuld-længde mRNA-sekventering-Nanopore

MRNA-sekventering i fuld længde - Nanopore fremhævet billede

RNA-sekventering har været et uvurderligt værktøj til omfattende transkriptomanalyse.Uden tvivl opnåede traditionel kortlæst sekvensering adskillige vigtige udviklinger her.Ikke desto mindre støder det ofte på begrænsninger i fuldlængde isoformidentifikationer, kvantificering, PCR-bias.

Nanopore-sekventering adskiller sig fra andre sekventeringsplatforme, ved at nukleotiderne aflæses direkte uden DNA-syntese og genererer lang læsning ved titusvis af kilobaser.Dette giver mulighed for direkte udlæsning, der krydser fuldlængde transskriptioner og tackler udfordringerne i undersøgelser på isoformniveau.

Platform:Nanopore PromethION

Bibliotek:cDNA-PCR

Kontakt os

Servicedetaljer

Demo resultater

Casestudie

Service fordele

● Lav sekvensbias

● Afsløring af cDNA-molekyler i fuld længde

● Der kræves færre data for at dække samme antal transskriptioner

● Identifikation af flere isoformer pr. gen

● Udtrykskvantificering i isoformniveau

Service specifikationer

Bibliotek

Platform

Anbefalet dataudbytte (Gb)

Kvalitetskontrol

cDNA-PCR (Poly-A beriget)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/prøve (afhængig af art)

Fuld længde forhold＞70 %

Gennemsnitlig kvalitetsscore: Q10

Bioinformatiske analyser

●Rå databehandling

● Udskriftsidentifikation

● Alternativ splejsning

● Ekspressionskvantificering i genniveau og isoformniveau

● Differentiel udtryksanalyse

● Funktionsannotering og berigelse (DEG'er og DET'er)

Prøvekrav og levering

Prøvekrav:

Nukleotider:

Konc.(ng/μl)

Mængde (μg)

Renhed

Integritet

≥ 100

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Begrænset eller ingen protein- eller DNA-kontamination vist på gel.

For planter: RIN≥7,0;

For dyr: RIN≥7,5;

5,0≥28S/18S≥1,0;

begrænset eller ingen basislinjestigning

Væv: Vægt (tør): ≥1 g

*For væv, der er mindre end 5 mg, anbefaler vi at sende lynfrosset (i flydende nitrogen) vævsprøve.

Cellesuspension: Celletal = 3×10⁶- 1×10⁷

*Vi anbefaler at sende frosset cellelysat.I tilfælde af at cellen tæller mindre end 5×10⁵, anbefales flashfrosset i flydende nitrogen, hvilket er at foretrække til mikroekstraktion.

Blodprøver: Volumen≥1 ml

Anbefalet prøvelevering

Beholder: 2 ml centrifugerør (stanniol anbefales ikke)

Prøvemærkning: Gruppe+replikat f.eks. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Forsendelse: 2、Tøris: Prøver skal pakkes i poser og begraves i tøris.

RNA-stabile rør: RNA-prøver kan tørres i RNA-stabiliseringsrør (f.eks. RNAstable®) og sendes i stuetemperatur.

Service Work Flow

Nukleotider:

Prøve levering

Biblioteksbyggeri

Sekvensering

Dataanalyse

Eftersalgsservice

Service Work Flow

Væv:

Eksperimentdesign

Prøve levering

RNA-ekstraktion

Biblioteksbyggeri

Sekvensering

Dataanalyse

Eftersalgsservice

Tidligere: MRNA-sekventering i fuld længde -PacBio

Næste: 10x Genomics Visium Spatial Transcriptome

1.Differentiel ekspressionsanalyse -Vulkanplot

Differentiel ekspressionsanalyse kan behandles på både genniveau for at identificere differentielt udtrykte gener (DEG'er) og på isoformniveau for at identificere differentielt

3(1)

udtrykte transskriptioner (DET'er)

2.Hierarkisk clustering heatmap

3.Alternativ splejsningsidentifikation og klassificering

Fem typer alternative splejsningsbegivenheder kan forudsiges af Astalavista.

4.Identifikation af alternativ polyadenylering (APA) hændelser og motiv ved 50 bp opstrøms for poly-A

BMK sag

Alternativ splejsningsidentifikation og kvantificering på isoformniveau ved nanopore fuldlængde transkriptomsekventering

Udgivet:Naturkommunikation, 2020

Sekvenseringsstrategi:

Gruppering: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E mutation);3. Normale B-celler

Sekventeringsstrategi: MinION 2D-bibliotekssekventering, PromethION 1D-bibliotekssekventering;kortlæste data fra samme prøver

Sekvenseringsplatform: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;

Nøgleresultater

1. Alternativ splejsningsidentifikation på isoformniveau

Langlæste sekvenser muliggør identifikation af mutant SF3B1^K700E-ændrede splejsningssteder på isoform-niveau.35 alternative 3'SS'er og 10 alternative 5'SS'er viste sig at være signifikant differentielt splejsede mellem SF3B1^K700Eog SF3B1^WT.33 af de 35 ændringer blev nyopdaget af langlæste sekvenser.

2. Kvantificering af alternativ splejsning på isoformniveau

Ekspression af intronretention (IR) isoformer i SF3B1^K700Eog SF3B1^WTblev kvantificeret baseret på nanopore-sekvenser, hvilket afslørede en global nedregulering af IR-isoformer i SF3B1^K700E.

Reference

Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Transkriptkarakterisering i fuld længde af SF3B1-mutation i kronisk lymfatisk leukæmi afslører nedregulering af tilbageholdte introner[J].Naturkommunikation.