Ikke-referencebaseret mRNA-sekventering-Illumina

mRNA-sekventering vedtager næste generations sekventeringsteknik (NGS) til at fange messenger-RNA (mRNA) fra eukaryot i en bestemt periode, som nogle specielle funktioner aktiverer.Det længste splejsede transkript blev kaldt 'Unigene' og brugt som referencesekvens for efterfølgende analyse, hvilket er et effektivt middel til at studere artens molekylære mekanisme og regulatoriske netværk uden reference.

Efter transkriptomdatasamling og unigen funktionel annotering

(1)SSR-analyse, CDS-forudsigelse og genstruktur vil blive udført.

(2) Kvantificering af unigen ekspression i hver prøve vil blive udført.

(3) Differentielt udtrykte unigener mellem prøver (eller grupper) vil blive opdaget baseret på unigen ekspression

(4) Clustering, funktionel annotering og berigelsesanalyse af differentielt udtrykte unigener vil blive udført

Kontakt os

Servicedetaljer

Bioinformatik

Demo resultater

Casestudie

Funktioner

● Uafhængig af ethvert referencegenom,

● Dataene kunne bruges til at analysere strukturen og udtrykket af transskriptioner

● Identificer variable klipningssteder

Service fordele

● BMKCloud-baseret resultatlevering: Resultaterne leveres som datafil og interaktiv rapport via BMKCloud-platformen, som tillader brugervenlig læsning af komplekse analyseoutput og tilpasset datamining på basis af standard bioinformatikanalyse.

● Eftersalgsservice: Eftersalgsservice er gyldig i 3 måneder efter projektafslutning, herunder projektopfølgning, fejlfinding, resultater Q&A mv.

Prøvekrav og levering

Prøvekrav:

Nukleotider:

Konc.(ng/μl)

Mængde (μg)

Renhed

Integritet

≥ 20

≥ 0,5

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Begrænset eller ingen protein- eller DNA-kontamination vist på gel.

For planter: RIN≥6,5;

For dyr: RIN≥7,0;

5,0≥28S/18S≥1,0;

begrænset eller ingen basislinjestigning

Væv: Vægt (tør): ≥1 g
*For væv, der er mindre end 5 mg, anbefaler vi at sende lynfrosset (i flydende nitrogen) vævsprøve.

Cellesuspension: Celletal = 3×10⁷
*Vi anbefaler at sende frosset cellelysat.I tilfælde af at cellen tæller mindre end 5×10⁵, flash frosset i flydende nitrogen anbefales.

Blodprøver:
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzol og 2mL blod(TRIzol:Blod=3:1)

Anbefalet prøvelevering

Beholder:
2 ml centrifugerør (stanniol anbefales ikke)
Prøvemærkning: Gruppe+replikat f.eks. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Forsendelse:
1.Tøris: Prøver skal pakkes i poser og begraves i tøris.
2.RNAstabile rør: RNA-prøver kan tørres i RNA-stabiliseringsrør (f.eks. RNAstable®) og sendes i stuetemperatur.

Service Work Flow

Eksperimentdesign

Prøve levering

RNA-ekstraktion

Biblioteksbyggeri

Sekvensering

Dataanalyse

Eftersalgsservice

Tidligere: Lang ikke-kodende sekventering-Illumina

Næste: Eukaryot mRNA-sekventering-Illumina

Bioinformatik

1.mRNA(denovo) Samlingsprincip

Ved Trinity er læsninger fragmenteret i mindre stykker, kendt som K-mer.Disse K-merer bruges derefter som frø, der skal udvides til contigs og derefter komponent baseret på contig-overlapninger.Endelig blev De Bruijn anvendt her til at genkende transskriptioner i komponenterne.

mRNA-(De-novo)-Oversigt-over-Trinity

mRNA (De novo) Oversigt over Trinity

2.mRNA (De novo) fordeling af genekspressionsniveau

RNA-Seq er i stand til at opnå en meget følsom vurdering af genekspression.Normalt er det påviselige interval for transskriptionsekspression FPKM i området fra 10^-2 til 10^6

mRNA-(De-novo)-Fordeling-af-FPKM-densitet-i-hver-prøve

mRNA (De novo) Fordeling af FPKM-densitet i hver prøve

3.mRNA (De novo) GO berigelsesanalyse af DEG'er

GO-databasen (Gene Ontology) er et struktureret biologisk annotationssystem, der indeholder et standardordforråd over gen- og genproduktfunktioner.Den indeholder flere niveauer, hvor jo lavere niveauet er, desto mere specifikke er funktionerne.

mRNA-(De-novo)-GO-klassificering-af-DEG'er-på-andet-niveau

mRNA (De novo) GO klassificering af DEG'er på andet niveau

BMK sag

Transkriptomanalyse af saccharosemetabolisme under løghævelse og udvikling i løg (Allium cepa L.)

Udgivet: grænser inden for plantevidenskab2016

Sekvenseringsstrategi

Illumina HiSeq2500

Samling af prøver

Utah Yellow Sweet Spain-kultivaren "Y1351" blev brugt i denne undersøgelse.Antallet af indsamlede prøver var
15. dag efter hævelse (DAS) af pæren (2 cm diameter og 3-4 g vægt), 30. DAS (5 cm diameter og 100-110 g vægt) og ~3 på den 40. DAS (7 cm diameter og 260-300 gram).

Nøgleresultater

1. i Venn-diagrammet blev i alt 146 grader detekteret på tværs af alle tre par af udviklingsstadier
2. "Carbohydrattransport og metabolisme" var repræsenteret af kun 585 unigener (dvs. 7% af den annoterede COG).
3. Unigener, der med succes er annoteret til GO-databasen, blev klassificeret i tre hovedkategorier for de tre forskellige stadier af pæreudvikling.Mest repræsenteret i hovedkategorien "biologisk proces" var "metabolisk proces", efterfulgt af "cellulær proces".I hovedkategorien "molekylær funktion" var de to mest repræsenterede kategorier "binding" og "katalytisk aktivitet".

PB-fuld-længde-RNA-Sequencing-case-studie

Histogram af klynger af orthologe grupper (COG) klassificering

Histogram af genontologi (GO) klassificering for unigener afledt af løg i tre udviklingsstadier

Venn-diagram, der viser gener differentielt udtrykt i to vilkårlige stadier af løgløgsudvikling

Reference

Zhang C, Zhang H, Zhan Z, et al.Transkriptomanalyse af saccharosemetabolisme under løghævelse og udvikling i løg (Allium cepa L.)[J].Frontiers in Plant Science, 2016, 7:1425-.DOI: 10.3389/fpls.2016.01425