Αλληλουχία RNA ενός πυρήνα
Τεχνικό Σχέδιο
Η απομόνωση των πυρήνων επιτυγχάνεται με το 10× Genomics ChromiumTM, το οποίο αποτελείται από σύστημα μικρορευστοποίησης οκτώ καναλιών με διπλές διασταυρώσεις. Σε αυτό το σύστημα, σφαιρίδια γέλης με γραμμωτούς κώδικες και εκκινητή, ένζυμα και έναν μόνο πυρήνα ενθυλακώνονται σε σταγόνα λαδιού μεγέθους νανολίτρου, δημιουργώντας το Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Μόλις σχηματιστεί το GEM, η κυτταρική λύση και η απελευθέρωση γραμμωτών κωδίκων εκτελούνται σε κάθε GEM. Το mRNA μεταγράφεται αντίστροφα σε μόρια cDNA με γραμμωτούς κώδικες 10× και UMI, τα οποία υπόκεινται περαιτέρω σε τυπική κατασκευή βιβλιοθήκης αλληλουχίας.
Χαρακτηριστικά
● Παρασκευή εναιωρήματος μονοπύρηνων από κατεψυγμένους ιστούς
● Σχηματισμός Gel Bead-in-Emulsion (GEM) που ακολουθείται από σύνθεση cDNA
● Κάθε χάντρα σε ένα GEM είναι φορτωμένο με αστάρια που αποτελούνται από 4 τμήματα:
ουρά πολυ(dT) για εκκίνηση mRNA και σύνθεση cDNA,
Μοναδικό Μοριακό Αναγνωριστικό (UMI) για τη διόρθωση της πόλωσης ενίσχυσης
10x barcode
Αλληλουχία δέσμευσης εναρκτήρα αλληλουχίας μερικής ανάγνωσης 1
Φόντα
Η αλληλουχία RNA ενός πυρήνα παρακάμπτει τους περιορισμούς της αλληλουχίας RNA μονοκυττάρου, επιτρέποντας:
● Η χρήση κατεψυγμένων δειγμάτων και δεν περιορίζεται μόνο σε φρέσκα δείγματα
● Χαμηλό στρες κατεψυγμένων κυττάρων σε σύγκριση με την ενζυματική επεξεργασία φρέσκων κυττάρων, που αντικατοπτρίζεται στα δεδομένα μεταγραφής με τη μορφή γονιδίων που προκαλούν λιγότερο στρες
● Δεν χρειάζεται προηγούμενη αφαίρεση των ερυθρών αιμοσφαιρίων
● Απεριόριστη διάμετρος κυψέλης
● Μεγάλη σειρά δειγμάτων που είναι κατάλληλα για ανάλυση, συμπεριλαμβανομένων πολύπλοκων και εύθραυστων τύπων ιστών που είναι επιρρεπείς σε συσσώρευση ή καταστροφή κυττάρων κατά τη διάσταση ιστού
Δείγματα που δεν μπορούν να αναλυθούν με προσδιορισμό αλληλουχίας RNA μονοκυττάρου και είναι κατάλληλα για προσδιορισμό αλληλουχίας RNA απλού πυρήνα:
| Κύτταρο / Ιστός | Λόγος |
| Μη φρέσκο κατεψυγμένο χαρτομάντιλο | Δεν είναι δυνατή η απόκτηση νέων ή από καιρό αποθηκευμένων οργανισμών |
| Μυϊκά κύτταρα, Μεγακαρυοκύτταρα, Λίπος… | Η διάμετρος του στοιχείου είναι πολύ μεγάλη για να εισέλθει στο όργανο |
| Συκώτι… | Πολύ εύθραυστο για να σπάσει, ανίκανο να διακρίνει μεμονωμένα κύτταρα |
| Κύτταρο νευρώνων, εγκέφαλος… | Πιο ευαίσθητο, εύκολο στο άγχος, θα αλλάξει τα αποτελέσματα της αλληλουχίας |
| Πάγκρεας, Θυρεοειδής… | Πλούσιο σε ενδογενή ένζυμα, που επηρεάζουν την παραγωγή μονοκυτταρικού εναιωρήματος |
Μεμονωμένος πυρήνας vs μονοκύτταρο
| Μονοπύρηνος | Μονοκύτταρο |
| Απεριόριστη διάμετρος κυψέλης | Διάμετρος κυψέλης: 10-40 μm |
| Το υλικό μπορεί να είναι παγωμένος ιστός | Το υλικό πρέπει να είναι φρέσκος ιστός |
| Χαμηλό στρες κατεψυγμένων κυττάρων | Η θεραπεία με ένζυμα μπορεί να προκαλέσει αντίδραση στρες των κυττάρων |
| Δεν χρειάζεται να αφαιρεθούν ερυθρά αιμοσφαίρια | Τα ερυθρά αιμοσφαίρια πρέπει να αφαιρεθούν |
| Το πυρηνικό εκφράζει βιοπληροφορίες | Ολόκληρο το κύτταρο εκφράζει βιοπληροφορίες |
Προδιαγραφές
| Απαιτήσεις δειγμάτων | Βιβλιοθήκη | Στρατηγική αλληλουχίας | Συνιστώμενα δεδομένα | Ποιοτικός έλεγχος |
| Αριθμός κινητού: σύνολο > 10^6ή > 5x105 ροή ταξινομημένα κύτταρα. Ιστός > 200 mg Ολικό αίμα > 4 mL | Βιβλιοθήκη cDNA 10x Genomics sn | Illumina PE150 | 100K αναγνώσεις PE ανά κελί (100-200 Gb) | 700-1200 πυρήνες/μl και η ακεραιότητα των πυρήνων παρατηρήθηκε στο μικροσκόπιο |
Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με την καθοδήγηση προετοιμασίας δειγμάτων και τη ροή εργασιών σέρβις, μη διστάσετε να μιλήσετε με τον αΕιδικός BMKGENE
Ροή εργασιών εξυπηρέτησης
Περιλαμβάνει την ακόλουθη ανάλυση:
● Ποιοτικός έλεγχος: αριθμός κυττάρων, ανίχνευση γονιδίων, ακριβής ταυτοποίηση κυττάρων, μόρια RNA και ποσοτικοποίηση έκφρασης
● Εσωτερική ανάλυση δείγματος:
Ομαδοποίηση κελιών και σχολιασμός συμπλέγματος
Ανάλυση διαφορικής έκφρασης: αναγνώριση των DEG σε συστάδες
Λειτουργικός σχολιασμός και εμπλουτισμός συμπλέγματος DEG
● Ανάλυση μεταξύ ομάδων:
Συνδυασμός δεδομένων
Ανάλυση διαφορικής έκφρασης: αναγνώριση των DEG σε ομάδες
Λειτουργικός σχολιασμός και εμπλουτισμός ομάδων DEG
● Προηγμένη ανάλυση:
Ανάλυση κυτταρικού κύκλου
Ψευδοχρονική ανάλυση
Ανάλυση κινητής επικοινωνίας (CellPhoneDB)
Ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA)
Ανάλυση εσωτερικού δείγματος
Ομαδοποίηση κυττάρων:
Ανάλυση διαφορικής έκφρασης: DEG συμπλέγματος
Ανάλυση μεταξύ ομάδων
Ανάλυση διαφορικής έκφρασης: Ομαδικές DEG
Προηγμένη ανάλυση:
Ανάλυση ψευδοχρόνου:
Ανάλυση κυτταρικού κύκλου:
Εξερευνήστε τις προόδους που διευκολύνονται από τις υπηρεσίες αλληλουχίας μονοπύρηνα RNA της BMKGene από το 10X Chromium σε αυτές τις επιλεγμένες εκδόσεις:
Wang, L. et al. (2021) «Μονοκυτταρική μεταγραφική ανάλυση αποκαλύπτει το ανοσοποιητικό τοπίο του πνεύμονα στην έξαρση του άσθματος ανθεκτικού στα στεροειδή»,Πρακτικά της Εθνικής Ακαδημίας Επιστημών των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής, 118(2), σελ. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, Η. et αϊ. (2022) «Ένα Παγκόσμιο Ρυθμιστικό Δίκτυο για τη Δυσρυθμισμένη Γονιδιακή Έκφραση και την Ανώμαλη Μεταβολική Σηματοδότηση σε Ανοσιακά Κύτταρα στο Μικροπεριβάλλον της Νόσου Graves και της Θυρεοειδίτιδας του Χασιμότο»,Σύνορα στην Ανοσολογία, 13, σελ. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, Η. et αϊ. (2023) «Το μεταγραφικό μονοκυττάρου αποκαλύπτει την ετερογένεια και τις ανοσολογικές αποκρίσεις των λευκοκυττάρων μετά τον εμβολιασμό με αδρανοποιημένη Edwardsiella tarda σε κολοκυθάκι (Paralichthys olivaceus)»,Υδατοκαλλιέργεια, 566, πίν. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Υ. et αϊ. (2023) «Η φωτοδυναμική θεραπεία βελτιώνει την έκβαση των αναστολέων του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου μέσω της αναδιαμόρφωσης της αντικαρκινικής ανοσίας σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου»,Καρκίνος στομάχου, 26(5), σσ. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
