Secuenciación larga sin codificación-Illumina
Ventajas del servicio
● Ventajas del servicio
● Específico para células y tejidos
● La etapa específica expresa y presenta un cambio de expresión dinámico.
● Patrones precisos de expresión temporal y espacial.
● Análisis conjunto con datos de ARNm.
● Entrega de resultados basada en BMKCloud: minería de datos personalizada disponible en la plataforma.
● Servicios posventa válidos por 3 meses una vez finalizado el proyecto.
Requisitos de muestra y entrega
| Biblioteca | Plataforma | Datos recomendados | Control de calidad de datos |
| agotamiento del ARNr | Iluminación PE150 | 10GB | Q30≥85% |
| Conc.(ng/μl) | Cantidad (μg) | Pureza | Integridad |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | DO260/280=1,7-2,5 DO260/230=0,5-2,5 En el gel se muestra contaminación limitada o nula de proteínas o ADN. | Para plantas: RIN≥6,5; Para animales: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; elevación basal limitada o nula |
Nucleótidos:
Tejido: Peso (seco): ≥1 g
*Para tejido de menos de 5 mg, recomendamos enviar una muestra de tejido congelada instantáneamente (en nitrógeno líquido).
Suspensión celular: Recuento de células = 3×107
*Recomendamos enviar lisado celular congelado.En caso de que la celda cuente menos de 5×105, se recomienda la congelación instantánea en nitrógeno líquido.
Muestras de sangre:
PA×genSangreARNTubo;
6 ml de TRIzol y 2 ml de sangre (TRIzol:Sangre=3:1)
Entrega de muestra recomendada
Envase: tubo de centrífuga de 2 ml (no se recomienda papel de aluminio)
Etiquetado de muestras: Grupo+réplica, por ejemplo, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Envío:
1. Hielo seco: las muestras deben empaquetarse en bolsas y enterrarse en hielo seco.
2.Tubos RNAstable: las muestras de ARN se pueden secar en un tubo de estabilización de ARN (por ejemplo, RNAstable®) y enviarse a temperatura ambiente.
Flujo de trabajo del servicio
Diseño de experimentos
Entrega de muestra
extracción de ARN
construcción de biblioteca
Secuenciación
Análisis de los datos
Servicios postventa
Bioinformática
1.Clasificación LncRNA
Los LncRNA predichos por los cuatro softwares anteriores se clasificaron en 4 categorías: lincRNA, LncRNA antisentido, LncRNA intrónico;sentido-LncRNA.La clasificación de LncRNA se muestra en el histograma siguiente.
Clasificación de ARNnc
2.Genes dirigidos a Cis del análisis de enriquecimiento de DE-lncRNA
ClusterProfiler se empleó en el análisis de enriquecimiento GO en genes dirigidos a cis de lncRNA expresado diferencialmente (DE-lncRNA), en términos de procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares.El análisis de enriquecimiento de GO es un proceso para identificar términos GO significativamente enriquecidos dirigidos por DEG en comparación con el genoma completo.Los términos enriquecidos se presentaron en histograma, gráfico de burbujas, etc., como se muestra a continuación.
Genes dirigidos a cis del análisis de enriquecimiento de DE-lncRNA: gráfico de burbujas
3. Al comparar la longitud, el número de exón, el ORF y la cantidad de expresión de ARNm y ARNc, podemos comprender las diferencias en estructura, secuencia, etc. entre ellos, y también verificar si el nuevo ARNc predicho por nosotros se ajusta a las características generales.
Caso BMK
Perfil de expresión desregulado de lncRNA en adenocarcinomas de pulmón de ratón con mutación KRAS‐G12D y knockout para P53
Publicado:Revista de Medicina Celular y Molecular,2019
Estrategia de secuenciación
iluminar
Coleccion de muestra
Las células KP (shRNA-2) de eliminación NONMMUT015812 y las células de control negativo (sh-Scr) se obtuvieron el día 6 de una infección viral específica.
Resultados clave
Este estudio investiga los lncRNA expresados de manera aberrante en el adenocarcinoma de pulmón de ratón con desactivación de P53 y la mutación KrasG12D.
Se expresaron diferencialmente 1,6424 lncRNA (cambio ≥ 2 veces, P <0,05).
2. Entre los 210 lncRNA (FC≥8), la expresión de 11 lncRNA fue regulada por P53, 33 lncRNA por KRAS y 13 lncRNA por hipoxia en las células KP primarias, respectivamente.
Para analizar su función celular se detectó 3.NONMMUT015812, que estaba notablemente regulado positivamente en el adenocarcinoma de pulmón de ratón y regulado negativamente por la reexpresión de P53.
4.La eliminación de NONMMUT015812 por shRNA disminuyó la capacidad de proliferación y migración de las células KP.NONMMUT015812 era un oncogén potencial.
 Análisis de la vía KEGG de los genes expresados diferencialmente en las células KP de eliminación NONMMUT015812 |  Análisis de ontología genética de los genes expresados diferencialmente en las células KP de eliminación NONMMUT015812 |
Referencia
Perfil de expresión desregulado de lncRNA en adenocarcinomas de pulmón de ratón con mutación KRAS-G12D y desactivación de P53 [J].Revista de Medicina Celular y Molecular, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
