Teljes hosszúságú mRNS szekvenálás - PacBio
Szolgáltatás előnyei
● A teljes hosszúságú cDNS molekula közvetlen kiolvasása a 3'-végtől az 5'-végig
● Iso-form szintű felbontás a sorozatstruktúrában
● Nagy pontosságú és integritású átiratok
● Nagyon kompatibilis a vaiours fajokkal
● Nagy szekvenálási kapacitás 4 PacBio Sequel II szekvenáló platformmal felszerelt
● Nagy tapasztalattal rendelkezik több mint 700 Pacbio-alapú RNS-szekvenálási projektben
● BMKCloud alapú eredményszolgáltatás: testreszabott adatbányászat elérhető a platformon.
● Értékesítés utáni szolgáltatások a projekt befejezését követően 3 hónapig érvényesek
Szolgáltatási specifikációk
Platform: PacBio Sequel II
Szekvenáló könyvtár: Poli A-val dúsított mRNS könyvtár
Javasolt adatmennyiség: 20 Gb/minta (fajtól függően)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Teljes hosszúságú, nem kiméra transzkriptumok
Bioinformatikai elemzések
● Nyers adatfeldolgozás
● Átirat azonosítása
● Sorozatstruktúra
● Kifejezés mennyiségi meghatározása
● Funkció Annotáció
Mintakövetelmények és szállítás
Mintakövetelmények:
Nukleotidok:
| Konc. (ng/μl) | Mennyiség (μg) | Tisztaság | Sértetlenség |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 A gélen korlátozott fehérje- vagy DNS-szennyeződés látható, vagy nincs. | Növényeknél: RIN≥7,5; Állatok esetében: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; korlátozott vagy nincs alapvonali emelkedés |
Szövet: Súly (száraz):≥1 g
*5 mg-nál kisebb szövetek esetén gyorsfagyasztott (folyékony nitrogénben) szövetminta küldését javasoljuk.
Sejtszuszpenzió:Sejtszám = 3×106- 1×107
* Javasoljuk fagyasztott sejtlizátum szállítását.Abban az esetben, ha az adott sejtszám kisebb, mint 5×105, folyékony nitrogénben gyorsfagyasztás javasolt, ami mikroextrakciónál előnyösebb.
Vérminták:Térfogat ≥1 ml
Mikroorganizmus:Tömeg ≥ 1 g
Javasolt mintaszállítás
Tartály:
2 ml-es centrifugacső (ón fólia nem ajánlott)
Mintacímkézés: Csoport+másolat pl. A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Szállítás:
1. Szárazjég: A mintákat zsákokba kell csomagolni, és szárazjégbe kell temetni.
2. RNS-stabil csövek: Az RNS-minták RNS-stabilizáló csőben (pl. RNAstable®) száríthatók és szobahőmérsékleten szállíthatók.
Szerviz munkafolyamat
Kísérleti tervezés
Mintaszállítás
RNS extrakció
Könyvtárépítés
Sorrendezés
Adatelemzés
Értékesítés utáni szolgáltatások
1.FLNC hosszeloszlás
A teljes hosszúságú, nem kiméra olvasás (FLNC) hossza a cDNS hosszát jelzi a könyvtár felépítésében.Az FLNC hossz-eloszlása döntő mutató a könyvtárépítés minőségének értékelésében.
FLNC olvasási hossz eloszlás
2. Teljes ORF régió hossz-eloszlás
A TransDecoder segítségével megjósoljuk a fehérjét kódoló régiókat és a megfelelő aminosavszekvenciákat az unigén készletek létrehozásához, amelyek minden mintában teljes, nem redundáns átírási információt tartalmaznak.
Teljes ORF régió hossz-eloszlás
3.KEGG útvonal dúsítási elemzés
A differenciálisan kifejezett transzkriptumok (DET-ek) azonosíthatók az NGS-alapú RNS-szekvenálási adatok összehangolásával a PacBio szekvenálási adatok által generált teljes hosszúságú transzkriptumkészleteken.Ezek a DET-ek tovább feldolgozhatók különféle funkcionális elemzésekhez, például KEGG-útvonal-dúsítási elemzéshez.
DET KEGG útvonal dúsítás -Dot plot
BMK tok
A Populus szár-transzkriptom fejlődési dinamikája
Közzétett: Plant Biotechnology Journal, 2019
Szekvenálási stratégia:
Minta kollekció:szárrégiók: csúcs, első internode (IN1), második internode (IN2), harmadik internode (IN3), internode (IN4) és internode (IN5) a Nanlin895-től
NGS-sorozat:15 egyed RNS-ét egy biológiai mintaként egyesítettük.Mindegyik pontból három biológiai ismétlést dolgoztunk fel NGS-szekvenciára
TGS-szekvencia:A szárrégiókat három régióra osztottuk, azaz csúcsra, IN1-IN3-ra és IN4-IN5-re.Mindegyik régiót PacBio szekvenáláshoz dolgoztuk fel négy típusú könyvtárral: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb és 3-10 kb.
Főbb eredmények
1. Összesen 87150 teljes hosszúságú átiratot azonosítottak, amelyekben 2081 új izoformát és 62058 új alternatív spliced izoformát azonosítottak.
2,1187 lncRNS-t és 356 fúziós gént azonosítottak.
3. Az elsődleges növekedéstől a másodlagos növekedésig 15838 eltérően expresszált transzkriptumot azonosítottak 995 eltérően expresszált génből.Az összes DEG-ben 1216 volt transzkripciós faktor, amelyek többségéről még nem számoltak be.
4.GO dúsítási analízis kimutatta a sejtosztódás és az oxidációs-redukciós folyamat fontosságát az elsődleges és másodlagos növekedésben.
Alternatív splicing események és különböző izoformák
WGCNA elemzés a transzkripciós faktorokról
Referencia
Chao Q, Gao ZF, Zhang D és mások.A Populus szár-transzkriptom fejlődési dinamikája.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
