Długie niekodujące sekwencjonowanie – Illumina
Zalety serwisu
● Zalety usług
● Specyficzne dla komórek i tkanek
● Specyficzna scena wyraża i prezentuje dynamiczną zmianę ekspresji
● Precyzyjne wzorce ekspresji czasu i przestrzeni
● Wspólna analiza z danymi mRNA.
● Dostarczanie wyników w oparciu o BMKCloud: Indywidualna eksploracja danych dostępna na platformie.
● Usługi posprzedażowe ważne przez 3 miesiące po zakończeniu projektu
Przykładowe wymagania i dostawa
| Biblioteka | Platforma | Zalecane dane | Kontrola danych |
| wyczerpanie rRNA | Illumina PE150 | 10 Gb | Q30≥85% |
| Stężenie (ng/μl) | Ilość (µg) | Czystość | Uczciwość |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Na żelu widoczne jest ograniczone lub żadne zanieczyszczenie białkiem lub DNA. | Dla roślin: RIN≥6,5; Dla zwierząt: RIN≥7,0; 5,0 ≥ 28 S/18 S ≥ 1,0; ograniczone lub żadne wzniesienie linii bazowej |
Nukleotydy:
Tkanka: Waga (sucha): ≥1 g
*W przypadku tkanki o masie mniejszej niż 5 mg zalecamy przesłanie próbki tkanki zamrożonej w ciekłym azocie.
Zawiesina komórek: Liczba komórek = 3 x 1007
*Zalecamy wysyłkę zamrożonego lizatu komórkowego.W przypadku, gdy liczba komórek jest mniejsza niż 5 × 105zaleca się błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie.
Próbki krwi:
PA×genBloodRNATube;
6 mlLTRIzolu i 2 ml krwi (TRIzol:krew=3:1)
Zalecana dostawa próbek
Pojemnik: probówka wirówkowa o pojemności 2 ml (nie zaleca się stosowania folii aluminiowej)
Przykładowe oznakowanie: Grupa+replika, np. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Wysyłka:
1.Suchy lód: Próbki należy zapakować do worków i zakopać w suchym lodzie.
2. Probówki RNAstable: Próbki RNA można suszyć w probówkach do stabilizacji RNA (np. RNAstable®) i przesyłać w temperaturze pokojowej.
Przebieg prac serwisowych
Projekt eksperymentu
Dostawa próbek
Ekstrakcja RNA
Budowa biblioteki
Sekwencjonowanie
Analiza danych
Usługi posprzedażowe
Bioinformatyka
1.Klasyfikacja LncRNA
LncRNA przewidywane przez cztery powyższe programy sklasyfikowano w 4 kategoriach: lincRNA, antysensowny LncRNA, intronowy-LncRNA;sens-LncRNA.Klasyfikację LncRNA przedstawiono na poniższym histogramie.
Klasyfikacja LncRNA
2.Analiza wzbogacania DE-lncRNA genów ukierunkowanych na Cis
Program ClusterProfiler wykorzystano do analizy wzbogacania GO w genach ukierunkowanych na cis lncRNA o różnej ekspresji (DE-lncRNA) pod kątem procesów biologicznych, funkcji molekularnych i składników komórkowych.Analiza wzbogacania GO to proces mający na celu identyfikację znacząco wzbogaconych terminów GO kierowanych przez DEG w porównaniu z całym genomem.Wzbogacone terminy przedstawiono na histogramie, wykresie bąbelkowym itp., jak pokazano poniżej.
Geny ukierunkowane na cis w analizie wzbogacenia DE-lncRNA - wykres bąbelkowy
3. Porównując długość, liczbę eksonów, ORF i wielkość ekspresji mRNA i lncRNA, możemy zrozumieć różnice w strukturze, sekwencji itp. między nimi, a także sprawdzić, czy przewidywany przez nas nowy lncRNA jest zgodny z ogólną charakterystyką.
Sprawa BMK
Deregulowany profil ekspresji lncRNA w gruczolakorakach płuc myszy z mutacją KRAS-G12D i nokautem P53
Opublikowany:Journal of Cellular and Molecular Medicine,2019
Strategia sekwencjonowania
Ilumina
Zbiór próbek
Komórki KP (shRNA-2) z nokautem NONMMUT015812 i komórki kontroli negatywnej (sh-Scr) uzyskano 6 dnia specyficznej infekcji wirusowej.
Kluczowe wyniki
W tym badaniu zbadano nieprawidłowo wyrażane lncRNA w gruczolakoraku płuc myszy z nokautem P53 i mutacją KrasG12D.
1,6424 lncRNA ulegało zróżnicowanej ekspresji (≥ 2-krotna zmiana, P < 0,05).
2. Spośród wszystkich 210 lncRNA (FC≥8) ekspresja 11 lncRNA była regulowana odpowiednio przez P53, 33 lncRNA przez KRAS i 13 lncRNA przez niedotlenienie w pierwotnych komórkach KP.
3.NONMMUT015812, którego ekspresja była znacząco zwiększona w gruczolakoraku płuc myszy i ujemnie regulowana przez ponowną ekspresję P53, została wykryta w celu analizy jego funkcji komórkowej.
4. Powalenie NONMMUT015812 przez shRNA zmniejszyło zdolność proliferacji i migracji komórek KP.NONMMUT015812 był potencjalnym onkogenem.
 Analiza szlaku KEGG genów o zróżnicowanej ekspresji w komórkach KP z nokautem NONMMUT015812 |  Analiza ontologii genów genów o zróżnicowanej ekspresji w komórkach KP z nokautem NONMMUT015812 |
Odniesienie
Deregulowany profil ekspresji lncRNA w gruczolakorakach płuc myszy z mutacją KRAS-G12D i nokautem P53 [J].Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
