Full-lengde mRNA-sekvensering-Nanopore
Tjenestefordeler
● Lav sekvensbias
● Avsløre cDNA-molekyler i full lengde
● Mindre data kreves for å dekke samme antall transkripsjoner
● Identifikasjon av flere isoformer per gen
● Uttrykkkvantifisering i isoformnivå
Tjenestespesifikasjoner
| Bibliotek | Plattform | Anbefalt datautbytte (Gb) | Kvalitetskontroll |
| cDNA-PCR(Poly-A-anriket) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/prøve (avhengig av art) | Full-lengde forhold＞70 % Gjennomsnittlig kvalitetspoeng: Q10
|
Bioinformatikkanalyser
●Behandling av rådata
● Transkripsjonsidentifikasjon
● Alternativ skjøting
● Ekspresjonskvantifisering i gennivå og isoformnivå
● Differensiell uttrykksanalyse
● Funksjonsannotering og berikelse (DEG og DET)
Prøvekrav og levering
Eksempelkrav:
Nukleotider:
| Kons.(ng/μl) | Mengde (μg) | Renhet | Integritet |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Begrenset eller ingen protein- eller DNA-kontaminering vist på gel. | For planter: RIN≥7,0; For dyr: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; begrenset eller ingen grunnlinjehøyde |
Vev: Vekt (tørr): ≥1 g
*For vev mindre enn 5 mg anbefaler vi å sende hurtigfrosset (i flytende nitrogen) vevsprøve.
Cellesuspensjon: Celletall = 3×106- 1×107
*Vi anbefaler å sende frosset cellelysat.I tilfelle den cellen teller mindre enn 5×105, anbefales hurtigfryst i flytende nitrogen, som er å foretrekke for mikroekstraksjon.
Blodprøver: Volum≥1 ml
Anbefalt prøvelevering
Beholder: 2 ml sentrifugerør (tinnfolie anbefales ikke)
Prøvemerking: Gruppe+replikat f.eks. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Forsendelse: 2、Tørris: Prøver må pakkes i poser og begraves i tørris.
- RNAstabile rør: RNA-prøver kan tørkes i RNA-stabiliseringsrør (f.eks. RNAstable®) og sendes i romtemperatur.
Servicearbeidsflyt
Nukleotider:
Prøvelevering
Bygging av bibliotek
Sekvensering
Dataanalyse
Ettersalgstjenester
Servicearbeidsflyt
Vev:
Eksperimentdesign
Prøvelevering
RNA-ekstraksjon
Bygging av bibliotek
Sekvensering
Dataanalyse
Ettersalgstjenester
1.Differensiell uttrykksanalyse -Vulkanplott
Differensiell ekspresjonsanalyse kan behandles på både gennivå for å identifisere differensielt uttrykte gener (DEGs) og på isoformnivå for å identifisere differensielt
uttrykte transkripsjoner (DET)
2.Hierarkisk clustering heatmap
3.Alternativ skjøteidentifikasjon og klassifisering
Fem typer alternative spleisehendelser kan forutsies av Astalavista.
4.Alternativ poly-adenylering (APA) hendelsesidentifikasjon og motiv ved 50 bp oppstrøms for poly-A
BMK sak
Alternativ skjøteidentifikasjon og kvantifisering på isoformnivå ved nanopore full-lengde transkriptomsekvensering
Publisert:Naturkommunikasjon, 2020
Sekvenseringsstrategi:
Gruppering: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E mutasjon);3. Normale B-celler
Sekvenseringsstrategi: MinION 2D-bibliotekssekvensering, PromethION 1D-bibliotekssekvensering;kortlest data fra samme prøver
Sekvenseringsplattform: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Nøkkelresultater
1. Alternativ skjøteidentifikasjon på isoformnivå
Langleste sekvenser muliggjør identifikasjon av mutant SF3B1K700E-endrede spleisesteder på isoformnivå.35 alternative 3′SSer og 10 alternative 5′SSer ble funnet å være signifikant differensielt spleiset mellom SF3B1K700Eog SF3B1WT.33 av de 35 endringene ble nylig oppdaget av langleste sekvenser.
2. Kvantifisering av alternativ skjøting på isoformnivå
Uttrykk av intronretensjon (IR) isoformer i SF3B1K700Eog SF3B1WTble kvantifisert basert på nanoporesekvenser, og avslørte en global nedregulering av IR-isoformer i SF3B1K700E.
Henvisning
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Full-lengde transkriptkarakterisering av SF3B1-mutasjon ved kronisk lymfatisk leukemi avslører nedregulering av beholdte introner [J].Naturkommunikasjon.
