-
Sekvenování jednojádrové RNA
Vývoj technik pro zachycení jednotlivých buněk a konstrukci vlastních knihoven, spolu s vysoce výkonným sekvenováním, způsobil revoluci ve studiích genové exprese na buněčné úrovni. Tento průlom umožňuje hlubší a komplexnější analýzu komplexních buněčných populací, překonává omezení spojená s průměrováním genové exprese napříč všemi buňkami a zachovává skutečnou heterogenitu v rámci těchto populací. Sekvenování RNA jednotlivých buněk (scRNA-seq) má sice nepopiratelné výhody, ale v některých tkáních, kde je vytvoření suspenze jednotlivých buněk obtížné a vyžaduje čerstvé vzorky, naráží na problémy. V BMKGene tuto překážku řešíme nabídkou sekvenování RNA jednotlivých jader (snRNA-seq) s využitím nejmodernější technologie 10X Genomics Chromium. Tento přístup rozšiřuje spektrum vzorků vhodných pro analýzu transkriptomu na úrovni jednotlivých buněk.
Izolace jader se provádí pomocí inovativního čipu 10X Genomics Chromium, který využívá osmikanálový mikrofluidní systém s dvojitým křížením. V tomto systému jsou gelové kuličky obsahující čárové kódy, primery, enzymy a jedno jádro zapouzdřeny v olejových kapkách o velikosti nanolitrů a tvoří tak gelové kuličky v emulzi (GEM). Po vytvoření GEM dochází v každém GEM k lýze buněk a uvolnění čárového kódu. Následně molekuly mRNA podléhají reverzní transkripci do cDNA, zahrnující 10X čárové kódy a jedinečné molekulární identifikátory (UMI). Tyto cDNA jsou poté podrobeny konstrukci standardní sekvenční knihovny, což usnadňuje robustní a komplexní zkoumání profilů genové exprese na úrovni jednotlivých buněk.
Platforma: 10× Genomics Chromium a Illumina NovaSeq
-
10x Genomics Visium Spatial Transcriptome
Prostorová transkriptomika je špičková technologie, která umožňuje výzkumníkům zkoumat vzorce genové exprese v tkáních a zároveň zachovat jejich prostorový kontext. Jednou z výkonných platforem v této oblasti je 10x Genomics Visium ve spojení se sekvenováním Illumina. Princip 10X Visium spočívá na specializovaném čipu s určenou oblastí pro zachycení, kam se umisťují řezy tkání. Tato oblast pro zachycení obsahuje čárově kódované skvrny, z nichž každá odpovídá jedinečné prostorové poloze v tkáni. Zachycené molekuly RNA z tkáně jsou poté během procesu reverzní transkripce označeny jedinečnými molekulárními identifikátory (UMI). Tyto čárově kódované skvrny a UMI umožňují přesné prostorové mapování a kvantifikaci genové exprese s rozlišením jedné buňky. Kombinace prostorově čárově kódovaných vzorků a UMI zajišťuje přesnost a specifičnost generovaných dat. Pomocí této technologie prostorové transkriptomiky mohou výzkumníci získat hlubší pochopení prostorové organizace buněk a komplexních molekulárních interakcí probíhajících v tkáních, což nabízí neocenitelné poznatky o mechanismech, které jsou základem biologických procesů v mnoha oblastech, včetně onkologie, neurověd, vývojové biologie, imunologie a botanických studií.
Platforma: 10X Genomics Visium a Illumina NovaSeq
-
Sekvenování mRNA v plné délce – nanopóry
Přestože je sekvenování mRNA založené na NGS všestranným nástrojem pro kvantifikaci genové exprese, jeho spoléhání se na krátké čtení omezuje jeho účinnost v komplexních transkriptomických analýzách. Na druhou stranu, sekvenování nanopórů využívá technologii dlouhých čtení, která umožňuje sekvenování transkriptů mRNA v plné délce. Tento přístup usnadňuje komplexní zkoumání alternativního sestřihu, genových fúzí, polyadenylace a kvantifikace izoforem mRNA.
Sekvenování nanopórů, metoda založená na elektrických signálech jednotlivých molekul z nanopórů v reálném čase, poskytuje výsledky v reálném čase. Dvouvláknová DNA, vedená motorickými proteiny, se váže na proteiny nanopórů vložené do biofilmu a při průchodu kanálem nanopórů pod vlivem rozdílu napětí se odvíjí. Charakteristické elektrické signály generované různými bázemi na řetězci DNA jsou detekovány a klasifikovány v reálném čase, což usnadňuje přesné a kontinuální sekvenování nukleotidů. Tento inovativní přístup překonává omezení krátkého čtení a poskytuje dynamickou platformu pro složitou genomickou analýzu, včetně komplexních transkriptomických studií, s okamžitými výsledky.
Platforma: Nanopore PromethION 48
-
Sekvenování mRNA v plné délce - PacBio
Ačkoli je sekvenování mRNA založené na NGS všestranným nástrojem pro kvantifikaci genové exprese, jeho spoléhání se na krátké čtení omezuje jeho použití v komplexních transkriptomických analýzách. Na druhou stranu, sekvenování PacBio (Iso-Seq) využívá technologii dlouhých čtení, která umožňuje sekvenování transkriptů mRNA v plné délce. Tento přístup usnadňuje komplexní zkoumání alternativního sestřihu, genových fúzí a polyadenylace. Existují však i jiné možnosti kvantifikace genové exprese kvůli velkému množství požadovaných dat. Technologie sekvenování PacBio se spoléhá na sekvenování jednotlivých molekul v reálném čase (SMRT), což poskytuje výraznou výhodu při zachycení transkriptů mRNA v plné délce. Tento inovativní přístup zahrnuje použití vlnovodů s nulovým módem (ZMW) a mikrofabrikovaných jamek, které umožňují pozorování aktivity DNA polymerázy v reálném čase během sekvenování. V těchto ZMW syntetizuje DNA polymeráza PacBio komplementární řetězec DNA a generuje dlouhé čtení, které pokrývají celé transkripty mRNA. Provoz PacBio v režimu kruhového konsenzuálního sekvenování (CCS) zvyšuje přesnost opakovaným sekvenováním stejné molekuly. Generované HiFi čtení má přesnost srovnatelnou s NGS, což dále přispívá ke komplexní a spolehlivé analýze komplexních transkriptomických znaků.
Platforma: PacBio Sequel II; PacBio Revio
-
Sekvenování eukaryotické mRNA - NGS
Sekvenování mRNA je technika, která využívá sekvenování nové generace k odhalení přítomnosti a množství molekul RNA v biologickém vzorku a poskytuje tak snímek genové exprese ve vzorku.
Díky širokému spektru aplikací tento špičkový nástroj odhaluje složité profily genové exprese, genové struktury a molekulární mechanismy spojené s rozmanitými biologickými procesy.
Tato technika je široce používána ve výzkumu, klinické diagnostice a vývoji léčiv, protože nabízí vhled do složitostí buněčné dynamiky a genetické regulace a poskytuje pevný základ pro podnícení zvědavosti o jejím potenciálu v různých oblastech.
Dostupné platformy: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
Sekvenování mRNA bez referenčních kritérií - NGS
Sekvenování mRNA umožňuje komplexní profilování všech transkriptů mRNA v buňkách za specifických podmínek. Tato špičková technologie slouží jako účinný nástroj, který odhaluje složité profily genové exprese, genové struktury a molekulární mechanismy spojené s různými biologickými procesy. Sekvenování mRNA, široce používané v základním výzkumu, klinické diagnostice a vývoji léčiv, nabízí vhled do složitostí buněčné dynamiky a genetické regulace.
Platforma: Illumina NovaSeq X; DNBSEQ-T7
-
Dlouhé nekódující sekvenování - Illumina
Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou delší než 200 nukleotidů, mají minimální kódovací potenciál a jsou klíčovými prvky v rámci nekódující RNA. Tyto RNA, které se nacházejí v jádře a cytoplazmě, hrají klíčovou roli v epigenetické, transkripční a posttranskripční regulaci, což podtrhuje jejich význam při formování buněčných a molekulárních procesů. Sekvenování LncRNA je mocným nástrojem v buněčné diferenciaci, ontogenezi a lidských onemocněních.
Platforma: Illumina NovaSeq X
-
Sekvenování malých RNA – Illumina
Malá RNA je skupina molekul RNA, která zahrnuje mikroRNA (miRNA), malé interferující RNA (siRNA) a piwi-interagující RNA (piRNA). Mezi nimi jsou miRNA, dlouhé přibližně 18–25 nukleotidů, obzvláště pozoruhodné pro svou klíčovou regulační roli v různých buněčných procesech. Díky tkáňově specifickým a stádiově specifickým expresním vzorcům vykazují miRNA vysokou konzervovanost napříč různými druhy.
Platforma: Illumina NovaSeq
-
Sekvenování CircRNA – Illumina
Cirkulární sekvenování RNA (circRNA-seq) profiluje a analyzuje cirkulární RNA, což je třída molekul RNA, které v důsledku nekanonických sestřihových událostí tvoří uzavřené smyčky, což této RNA poskytuje zvýšenou stabilitu. Zatímco některé circRNA prokazatelně fungují jako houby mikroRNA, sekvestrují mikroRNA a brání jim v regulaci cílových mRNA, jiné circRNA mohou interagovat s proteiny, modulovat genovou expresi nebo hrát roli v buněčných procesech. Analýza exprese circRNA poskytuje vhled do regulačních rolí těchto molekul a jejich významu v různých buněčných procesech, vývojových stádiích a chorobných stavech, což přispívá k hlubšímu pochopení složitosti regulace RNA v kontextu genové exprese.
Platforma: Illumina Novaseq X
-
Sekvenování celého transkriptomu – Illumina
Woleovo transkriptomové sekvenování nabízí komplexní přístup k profilování různých molekul RNA, zahrnující kódující (mRNA) i nekódující RNA (lncRNA, circRNA a miRNA). Tato technika zachycuje celý transkriptom specifických buněk v daném okamžiku, což umožňuje holistické pochopení buněčných procesů.
Dostupné platformy: Illumina Novaseq X
