Sequenziamentu di RNA à nuclei singuli
Schema Tecnicu
L'isolamentu di i nuclei hè ottenutu da 10× Genomics Chromium™, chì consiste in un sistema microfluidico à ottu canali cù doppi incroci. In questu sistema, una perla di gel cù codici a barre è primer, enzimi è un unicu nucleu sò incapsulati in una goccia d'oliu di a dimensione di nanolitri, generendu Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Una volta chì i GEM sò furmati, a lisi cellulare è u rilasciu di i codici a barre sò realizati in ogni GEM. L'mRNA hè trascritto inversamente in molecule di cDNA cù codici a barre 10× è UMI, chì sò ulteriormente sottumessi à a custruzzione di una biblioteca di sequenziamento standard.
Funziunalità
● Preparazione di sospensioni di nuclei singuli da tessuti congelati
● Furmazione di Gel Bead-in-Emulsion (GEM) seguita da a sintesi di cDNA
● Ogni perla in un GEM hè caricata cù primer cumposti da 4 sezioni:
coda di poli(dT) per l'innesco di l'mRNA è a sintesi di cDNA,
Identificatore Moleculare Unicu (UMI) per curregge u pregiudiziu di amplificazione
10x codice à barre
Sequenza di legame di u primer di sequenziamentu di lettura parziale 1
Vantaghji
U sequenziamentu di l'ARN à nucleu unicu aggira i limiti di u sequenziamentu di l'ARN à cellula singola, permettendu:
● L'usu di campioni congelati è micca solu limitatu à campioni freschi
● Stress bassu di e cellule congelate in paragone à u trattamentu enzimaticu di e cellule fresche, riflessu in i dati di u trascrittoma in forma di menu geni indotti da stress
● Nisuna necessità di rimuzione previa di globuli rossi
● Diametru di cellula illimitatu
● Vasta gamma di campioni eligibili per l'analisi, cumpresi i tipi di tessuti cumplessi è fragili chì sò propensi à l'agglomerazione o a distruzzione cellulare durante a dissociazione tissutale
Campioni chì ùn ponu esse analizati per sequenziamentu di ARN di una sola cellula è chì sò eligibili per u sequenziamentu di ARN di un solu nucleu:
| Cellula / Tessutu | Ragione |
| Sguassà u tissutu congelatu | Ùn si pò ottene urganisazioni fresche o salvate dapoi tantu tempu |
| Cellula musculare, megacariocita, grassu… | U diametru di a cellula hè troppu grande per entre in u strumentu |
| Fegatu… | Troppu fragile per rompe, incapace di distingue e singole cellule |
| Cellula neuronale, Cervellu… | Più sensibile, faciule da stressà, cambierà i risultati di u sequenziamentu |
| Pancreas, Tiroide… | Riccu in enzimi endogeni, chì affettanu a pruduzzione di sospensione di cellule singole |
Nucleu unicu vs. cellula unica
| Nucleu unicu | Cellula unica |
| Diametru di cellula illimitatu | Diametru di a cellula: 10-40 μm |
| U materiale pò esse tissutu congelatu | U materiale deve esse tissutu frescu |
| Stress bassu di e cellule congelate | U trattamentu enzimaticu pò causà una reazione di stress cellulare |
| Nisun globulu rossu hà bisognu di esse eliminatu | I globuli rossi devenu esse eliminati |
| U nucleare sprime a bioinfurmazione | Tutta a cellula esprime a bioinfurmazione |
Specifiche
| Requisiti di Campione | Biblioteca | Strategia di sequenziamentu | Dati cunsigliati | Cuntrollu di qualità |
| Tessutu animale ≥ 200 mg Tessutu vegetale ≥ 400 mg | 10x Libreria di cDNA sn di Genomics | Illumina PE150 | 100K letture PE per cellula (100-200 Gb) | 700-1200 nuclei/μl è integrità di i nuclei osservata à u microscopiu |
Per più dettagli nantu à a guida di preparazione di campioni è u flussu di travagliu di serviziu, ùn esitate micca à parlà cun unEspertu BMKGENE
Flussu di travagliu di serviziu
Include l'analisi seguente:
● Cuntrollu di qualità: numeru di cellule, rilevazione di geni, identificazione precisa di e cellule, molecule di RNA è quantificazione di l'espressione
● Analisi di u Campione Internu:
Raggruppamentu di cellule è annotazione di cluster
Analisi di Espressione Differenziale: identificazione di DEG in cluster
Annotazione funzionale è arricchimentu di i DEG di cluster
● Analisi intergruppu:
Cumbinazione di dati
Analisi di Espressione Differenziale: identificazione di DEG in gruppi
Annotazione funzionale è arricchimentu di i DEG di gruppu
● Analisi Avanzata:
Analisi di u ciclu cellulare
Analisi di pseudotempu
Analisi di a cumunicazione cellulare (CellPhoneDB)
Analisi di l'Arricchimentu di u Set di Geni (GSEA)
Analisi di u campione internu
Aggruppamentu di cellule:
Analisi di Espressione Differenziale: cluster DEGs
Analisi intergruppu
Analisi di l'espressione differenziale: Gruppu di DEG
Analisi Avanzata:
Analisi di pseudotempu:
Analisi di u ciclu cellulare:
Esplora i progressi facilitati da i servizii di sequenziamentu di RNA à nucleu unicu di BMKGene da 10X Chromium in queste publicazioni in evidenza:
Wang, L. et al. (2021) 'L'analisi trascrittomica di una sola cellula rivela u paisaghju immune di u pulmone in l'esacerbazione di l'asma resistente à i steroidi',Atti di l'Accademia Naziunale di Scienze di i Stati Uniti d'America, 118(2), p. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Una rete regulatoria globale per l'espressione genica disregulata è a segnalazione metabolica anormale in e cellule immunitarie in u microambiente di a malattia di Graves è di a tiroidite di Hashimoto',Frontiere in Immunologia, 13, p. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'U trascrittoma di una sola cellula scopre l'eterogeneità è e risposte immunitarie di i leucociti dopu a vaccinazione cù Edwardsiella tarda inattivata in a platessa (Paralichthys olivaceus)',Acquacultura, 566, p. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) "A terapia fotodinamica migliora u risultatu di l'inibitori di i punti di cuntrollu immunitari per via di a rimodellazione di l'immunità antitumorale in i pazienti cun cancru gastricu",Cancru gastricu, 26(5), pp. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
