Pagsunod-sunod ng RNA na may Iisang Nuklei
Teknikal na Iskema
Ang paghihiwalay ng mga nuclei ay nakakamit sa pamamagitan ng 10× Genomics Chromium™, na binubuo ng walong-kanal na sistemang microfluidics na may dobleng crossing. Sa sistemang ito, ang mga gel beads na may mga barcode at primer, mga enzyme at isang nucleus ay inilalagay sa isang patak ng langis na kasinglaki ng nanoliter, na bumubuo ng Gel Bead-in-Emulsion (GEM). Kapag nabuo na ang GEM, isinasagawa ang cell lysis at paglabas ng mga barcode sa bawat GEM. Ang mga mRNA ay binabaligtad na isinasalin sa mga molekula ng cDNA na may 10× barcode at UMI, na karagdagang napapailalim sa karaniwang konstruksyon ng sequencing library.
Mga Tampok
● Paghahanda ng single-nuclei suspension mula sa mga nagyelong tisyu
● Pagbuo ng Gel Bead-in-Emulsion (GEM) na sinusundan ng sintesis ng cDNA
● Ang bawat bead sa isang GEM ay puno ng mga primer na binubuo ng 4 na seksyon:
buntot na poly(dT) para sa paghahanda ng mRNA at sintesis ng cDNA,
Unique Molecular Identifier (UMI) upang itama ang amplification bias
10x barcode
Pagkakasunod-sunod ng pagbubuklod ng bahagyang nabasang 1 na panimulang aklat sa pagkakasunud-sunod
Mga Kalamangan
Nilalampasan ng single-nucleus RNA sequencing ang mga limitasyon ng single-cell RNA sequencing, na nagbibigay-daan sa:
● Ang paggamit ng mga nakapirming sample at hindi lamang limitado sa mga sariwang sample
● Mababang stress ng mga nakapirming selula kumpara sa enzymatic treatment ng mga sariwang selula, na makikita sa transcriptome data sa anyo ng mga gene na hindi gaanong dulot ng stress
● Hindi na kailangan ng paunang pag-alis ng mga pulang selula ng dugo
● Walang limitasyong diyametro ng selula
● Malaking hanay ng mga sample na maaaring suriin, kabilang ang mga kumplikado at marupok na uri ng tissue na madaling magkumpol o masira ang mga cell habang nagkakahiwalay ang tissue
Mga sample na hindi maaaring suriin sa pamamagitan ng single-cell RNA sequencing at karapat-dapat para sa single nuclei RNA sequencing:
| Selyula / Tisyu | Dahilan |
| Hindi sariwang nagyelong tisyu | Hindi makakuha ng mga bago o matagal nang nailigtas na organisasyon |
| Selula ng kalamnan, Megakaryocyte, Taba… | Masyadong malaki ang diyametro ng cell para makapasok sa instrumento |
| Atay… | Masyadong marupok para mabasag, hindi makilala ang mga indibidwal na selula |
| Selula ng neuron, Utak… | Mas sensitibo, madaling ma-stress, at magbabago sa mga resulta ng sequencing |
| Lapay, Tiroid… | Mayaman sa endogenous enzymes, na nakakaapekto sa produksyon ng single cell suspension |
Single-nucleus vs Single-cell
| Isang nukleo | Isang selula |
| Walang limitasyong diyametro ng selula | Diyametro ng selula: 10-40 μm |
| Ang materyal ay maaaring frozen tissue | Ang materyal ay dapat na sariwang tisyu |
| Mababang stress ng mga nakapirming selula | Ang paggamot gamit ang enzyme ay maaaring magdulot ng reaksiyon sa stress ng selula |
| Hindi na kailangang tanggalin ang mga pulang selula ng dugo | Kailangang tanggalin ang mga pulang selula ng dugo |
| Nagpapahayag ang Nuklear ng bioinformation | Ang buong selula ay nagpapahayag ng bioinformation |
Mga detalye
| Mga Kinakailangan sa Halimbawa | Aklatan | Istratehiya sa pagkakasunud-sunod | Inirerekomendang datos | Kontrol ng Kalidad |
| Tisyu ng hayop ≥ 200 mg Tisyu ng halaman ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA library | Illumina PE150 | 100K PE reads kada cell (100-200 GB) | 700-1200 nuclei/μl at integridad ng nuclei ang naobserbahan sa ilalim ng mikroskopyo |
Para sa karagdagang detalye tungkol sa gabay sa paghahanda ng sample at daloy ng trabaho sa serbisyo, huwag mag-atubiling makipag-usap sa isangEksperto sa BMKGENE
Daloy ng Trabaho sa Serbisyo
Kabilang dito ang sumusunod na pagsusuri:
● Kontrol sa Kalidad: bilang ng mga selula, pagtuklas ng gene, tumpak na pagkakakilanlan ng mga selula, mga molekula ng RNA at pagkuwantipika ng ekspresyon
● Panloob na Pagsusuri ng Sample:
Pagkumpol ng cell at anotasyon ng kumpol
Pagsusuri ng Differential Expression: pagkilala sa mga DEG sa mga kumpol
Functional annotation at pagpapayaman ng mga cluster DEG
● Pagsusuri sa pagitan ng mga grupo:
Kombinasyon ng datos
Pagsusuri ng Differential Expression: pagkilala sa mga DEG sa mga grupo
Functional annotation at pagpapayaman ng mga group DEG
● Masusing Pagsusuri:
Pagsusuri ng siklo ng selula
Pagsusuri ng pseudotime
Pagsusuri ng komunikasyon sa cell (CellPhoneDB)
Pagsusuri ng Pagpapayaman ng Gene Set (GSEA)
Pagsusuri ng panloob na sample
Pagkumpol ng mga selula:
Pagsusuri ng Differential Expression: mga cluster DEG
Pagsusuri sa pagitan ng mga grupo
Pagsusuri ng Differential Expression: Mga Group DEG
Mas Masusing Pagsusuri:
Pagsusuri ng pseudotime:
Pagsusuri ng siklo ng selula:
Tuklasin ang mga pagsulong na pinadali ng mga serbisyo ng single-nucleus RNA sequencing ng BMKGene sa pamamagitan ng 10X Chromium sa mga itinatampok na publikasyong ito:
Wang, L. et al. (2021) 'Ipinapakita ng single-cell transcriptomic analysis ang immune landscape ng baga sa steroid-resistant asthma exacerbation',Mga Pamamaraan ng Pambansang Akademya ng mga Agham ng Estados Unidos ng Amerika, 118(2), p. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) 'Isang Pandaigdigang Network ng Regulasyon para sa Dysregulated Gene Expression at Abnormal Metabolic Signaling sa mga Immune Cell sa Microenvironment ng Graves' Disease at Hashimoto's Thyroiditis',Mga Hangganan sa Imunolohiya, 13, p. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Ibinubunyag ng single-cell transcriptome ang heterogeneity at immune responses ng mga leukocyte pagkatapos ng pagbabakuna gamit ang inactivated na Edwardsiella tarda sa flounder (Paralichthys olivaceus)',Aquaculture, 566, p. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Pinapabuti ng photodynamic therapy ang kinalabasan ng mga immune checkpoint inhibitor sa pamamagitan ng pagbabago ng anti-tumor immunity sa mga pasyenteng may kanser sa tiyan',Kanser sa Tiyan, 26(5), pp. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
