Folsleine lingte mRNA sequencing -PacBio

De novofolsleine-lingte transkriptoom sequencing, ek bekend asDe novoIso-Seq nimt de foardielen fan PacBio sequencer yn lêslingte, dy't sequencing fan cDNA-molekulen mei folsleine lingte mooglik makket sûnder pauzes.Dit foarkomt folslein alle flaters generearre yn transkripsje-assemblagestappen en konstruearret unige sets mei resolúsje op isoformnivo.Dizze unigeensets leveret krêftige genetyske ynformaasje as "referinsjegenoom" op transkriptoomnivo.Dêrneist, kombinearjen mei folgjende generaasje sequencing gegevens, dizze tsjinst machtigt in krekte kwantifikaasje fan isoform-nivo ekspresje.

Platfoarm: PacBio Sequel II

Bibleteek: SMRT bell bibleteek

Kontakt mei ús opnimme

Service Details

Demo Results

Gefal stúdzje

Service Foardielen

● Direkte útlêzen fan cDNA-molekule fan folsleine lingte fan 3'- ein nei 5'- ein

● Iso-foarmnivo-resolúsje yn folchoarderstruktuer

● Transkripsjes mei hege krektens en yntegriteit

● Heech kompatibel mei vaiours soarten

● Grutte sequencing kapasiteit mei 4 PacBio Sequel II sequencing platfoarms útrist

● Heech belibbe mei mear as 700 Pacbio-basearre RNA-sequencing-projekten

● BMKCloud-basearre resultaatferliening: Oanpaste data-mining beskikber op platfoarm.

● Nei-ferkeap tsjinsten jildich foar 3 moannen nei projekt foltôging

Service Spesifikaasjes

Platfoarm: PacBio Sequel II

Sequencing bibleteek: Poly A-ferrike mRNA bibleteek

Oanrikkemandearre gegevensopbringst: 20 Gb/sample (ôfhinklik fan soarten)

FLNC (%): ≥75%

*FLNC: Folsleine lingte net-chimeryske transsipten

Bioinformatika analyzes

● Raw gegevens ferwurking

● Transkripsje identifikaasje

● Sequence struktuer

● Expression Quantification

● Funksje Annotaasje

Sample easken en levering

Sample easken:

Nukleotiden:

Konk.(ng/μl)

Bedrach (μg)

Purity

Yntegriteit

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Beheinde as gjin proteïne- of DNA-fersmoarging werjûn op gel.

Foar planten: RIN≥7.5;

Foar bisten: RIN≥8.0;

5.0≥ 28S/18S≥1.0;

beheind of gjin baseline hichte

Tissue: Gewicht (droech):≥1 g
* Foar weefsel lytser dan 5 mg, riede wy oan om flash beferzen (yn floeibere stikstof) weefselmonster te stjoeren.

Cell suspension:Seltal = 3×10⁶- 1×10⁷
* Wy riede oan om beferzen sel lysate te ferstjoeren.Yn gefal dat sel telt lytser as 5 × 10⁵, flash beferzen yn floeibere stikstof wurdt oanrikkemandearre, dat is de foarkar foar mikro-ekstraksje.

Bloedmonsters:Volume ≥1 mL

Mikroorganisme:Massa ≥ 1 g

Oanrikkemandearre Sample Delivery

Kontener:
2 ml sintrifugebuis (Tin folie wurdt net oanrikkemandearre)
Sample labeling: Groep + replikearje bgl. A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Ferstjoering:

1. Dry-ice: Samples moatte wurde ynpakt yn sekken en begroeven yn droech-iis.
2. RNAstable buizen: RNA samples kinne wurde droege yn RNA stabilisaasje buis (bgl RNAstable®) en ferstjoerd yn keamertemperatuer.

Service Work Flow

Eksperimint ûntwerp

Sample levering

RNA-ekstraksje

Biblioteekbou

Sequencing

Data analyze

Nei-ferkeap tsjinsten

Foarige: Eukaryotic mRNA Sequencing-Illumina

Folgjende: Full-Length mRNA Sequencing-Nanopore

1.FLNC lingte ferdieling

Lengte fan folsleine-lingte net-chimeric lêzen (FLNC) jout lingte fan cDNA yn biblioteek konstruksje.FLNC-lingteferdieling is in krúsjale yndikator by it evaluearjen fan kwaliteit fan biblioteekbou.

mRNA-FLNC-lêslingte-ferdieling

FLNC lêzen lingte ferdieling

2.Complete ORF regio lingte ferdieling

Wy brûke TransDecoder om proteïnekodearjende regio's en korrespondearjende aminosoeren-sekwinsjes te foarsizzen om unigene-sets te generearjen, dy't folsleine net-oerstallige transkripsjeynformaasje yn alle samples befettet.

mRNA-folsleine-ORF-lingte-ferdieling

Folsleine ORF regio lingte ferdieling

3.KEGG pathway ferriking analyze

Differinsjaal útdrukte transkripten (DET's) kinne wurde identifisearre troch NGS-basearre RNA-sekwinsjegegevens út te rjochtsjen op transkriptsets fan folsleine lingte generearre troch PacBio-sekwinsjegegevens.Dizze DET's kinne fierder ferwurke wurde foar ferskate funksjonele analyse, bygelyks KEGG-paadferrikingsanalyse.

mRNA-DEG-KEGG-paad-ferriking

DET KEGG paadferriking -Dot plot

BMK gefal

De ûntwikkelingsdynamyk fan it Populus stam transkriptoom

Publisearre: Plant Biotechnology Journal, 2019

Sequencing strategy:
Sample samling:stamregio's: apex, earste ynternoade (IN1), twadde ynternoade (IN2), tredde ynternoade (IN3), ynternoade (IN4) en ynternoade (IN5) fan Nanlin895
NGS-sekwinsje:RNA fan 15 persoanen waarden sammele as ien biologysk stekproef.Trije biologyske replikaten fan elke punten waarden ferwurke foar NGS-sekwinsje
TGS-sekwinsje:Stemregio's waarden ferdield yn trije regio's, ie apex, IN1-IN3 en IN4-IN5.Elke regio waard ferwurke foar PacBio-sekwinsje mei fjouwer soarten bibleteken: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb en 3-10 kb.

Key resultaten

1.In totaal fan 87150 folsleine transkripsjes waarden identifisearre, wêryn 2081 nije isofoarmen en 62058 nije alternative spliced isofoarmen waarden identifisearre.
2.1187 lncRNA en 356 fúzjegenen waarden identifisearre.
3.From primêre groei nei sekundêre groei waarden 15838 differinsjaal útdrukte transkrippen fan 995 differinsjaal útdrukte genen identifisearre.Yn alle DEG's wiene 1216 transkripsjefaktoaren, wêrfan de measte noch net rapportearre binne.
4.GO-ferrikingsanalyse die bliken belang fan seldieling en oksidaasje-reduksjeproses yn primêre en sekundêre groei.