Секвенционирање на мРНК со целосна должина - PacBio
Предности на услугата
● Директно читање на молекулата на cDNA со целосна должина од 3'-крај до 5'-крај
● Резолуција на ниво на изо-форма во структурата на низата
● Транскрипти со висока точност и интегритет
● Високо компатибилен со видовите невини
● Голем капацитет за секвенционирање со 4 опремени платформи за секвенционирање PacBio Sequel II
● Високо искуство со преку 700 проекти за секвенционирање на РНК базирани на Pacbio
● Испорака на резултати базирани на BMKCloud: приспособено ископување податоци достапно на платформата.
● Услуги по продажбата важат 3 месеци по завршувањето на проектот
Спецификации за услуги
Платформа: PacBio Sequel II
Библиотека за секвенционирање: mRNA библиотека збогатена со Poly A
Препорачан принос на податоци: 20 Gb/примерок (во зависност од видот)
FLNC (%): ≥75%
*FLNC: Нехимерички трансципти со целосна должина
Биоинформатички анализи
● Обработка на необработени податоци
● Идентификација на препис
● Структура на низа
● Квантификација на изразување
● Прибелешка на функцијата
Примерок барања и испорака
Барања за примероци:
Нуклеотиди:
| Конк.(ng/μl) | Количина (μg) | Чистота | Интегритет |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Ограничена или никаква контаминација на протеини или ДНК е прикажана на гелот. | За растенија: RIN≥7,5; За животни: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; ограничена или без основна елевација |
Ткиво: Тежина (суво):≥ 1 g
*За ткиво помало од 5 mg, препорачуваме да се испрати флеш замрзнато (во течен азот) примерок од ткиво.
Клеточна суспензија:Број на клетки = 3×106- 1×107
*Препорачуваме да се испорача замрзнат клеточен лизат.Во случај таа ќелија да брои помала од 5×105, се препорачува блиц замрзнато во течен азот, што е подобро за микро екстракција.
Примероци од крв:Волумен≥1 mL
Микроорганизам:Маса ≥ 1 g
Препорачана испорака на примероци
Контејнер:
Центрифуга епрувета од 2 ml (не се препорачува лимена фолија)
Обележување на примерокот: Група+реплика на пр. A1, A2, A3;Б1, Б2, Б3... ...
Испорака:
1. Сув мраз: примероците треба да се пакуваат во вреќи и да се закопаат во сув мраз.
2. РНК стабилни цевки: РНК примероците може да се сушат во епрувета за стабилизација на РНК (на пр. RNAstable®) и да се испратат на собна температура.
Тек на услужна работа
Дизајн на експеримент
Испорака на примероци
Екстракција на РНК
Изградба на библиотека
Секвенционирање
Анализа на податоци
Услуги по продажба
1.Дистрибуција на должина на FLNC
Должината на нехимеричкото читање со целосна должина (FLNC) ја покажува должината на cDNA во конструкцијата на библиотеката.Распределбата на должината на FLNC е клучен индикатор за оценување на квалитетот на изградбата на библиотеката.
Дистрибуција на должина на читање FLNC
2. Комплетна дистрибуција на должината на регионот ORF
Ние користиме TransDecoder за да ги предвидиме регионите за кодирање на протеини и соодветните секвенци на аминокиселини за да генерираме унигенски множества, кои содржат целосни не-непотребни информации за транскрипти во сите примероци.
Целосна дистрибуција на должината на регионот ORF
3.Анализа на збогатување на патеката KEGG
Диференцијално изразените транскрипти (DET) може да се идентификуваат со усогласување на податоците за секвенционирање на РНК базирани на NGS на комплети транскрипти со целосна должина генерирани од податоците за секвенционирање на PacBio.Овие DET може дополнително да се обработуваат за различни функционални анализи, на пр. KEGG анализа на збогатување на патеката.
Збогатување на патеката DET KEGG -Точка
Случај БМК
Развојната динамика на транскриптомот на стеблото Populus
Објавено: Весник за биотехнологија на растенијата, 2019 година
Стратегија за секвенционирање:
Колекција на примероци:матични региони: врв, прва меѓујазла (IN1), втора интернода (IN2), трета интернода (IN3), меѓујаз (IN4) и меѓујазол (IN5) од Nanlin895
NGS-секвенца:РНК од 15 лица беа здружени како еден биолошки примерок.Три биолошки реплики на секоја точка беа обработени за NGS секвенца
TGS-секвенца:Матичните региони беа поделени на три региони, т.е. врв, IN1-IN3 и IN4-IN5.Секој регион беше обработен за секвенционирање на PacBio со четири типа библиотеки: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb и 3-10 kb.
Клучни резултати
1. Идентификувани се вкупно 87150 преписи со целосна должина, во кои се идентификувани 2081 нови изоформи и 62058 нови алтернативни споени изоформи.
Идентификувани се 2,1187 lncRNA и 356 фузиони гени.
3. Од примарен раст до секундарен раст, идентификувани се 15838 диференцијално изразени транскрипти од 995 диференцијално изразени гени.Во сите DEG, 1216 беа фактори на транскрипција, од кои повеќето сè уште не се пријавени.
Анализата на збогатување 4.GO ја откри важноста на клеточната делба и процесот на оксидација-редукција во примарниот и секундарниот раст.
Алтернативни настани за спојување и различни изоформи
WGCNA анализа на факторите на транскрипција
Референца
Чао Кју, Гао ЗФ, Џанг Д и др.Развојната динамика на транскриптомот на стеблото Populus.Plant Biotechnol J. 2019; 17 (1): 206-219.doi:10.1111/pbi.12958
