Secvențierea ARNm de lungime completă-Nanopore
Avantajele serviciului
● Prejudecată de secvență scăzută
● Dezvăluirea moleculelor de cADN cu lungime completă
● Mai puține date necesare pentru a acoperi același număr de transcrieri
● Identificarea mai multor izoforme per genă
● Cuantificarea expresiei la nivel de izoforme
Specificații de service
| Bibliotecă | Platformă | Randament de date recomandat (Gb) | Control de calitate |
| cADN-PCR (îmbogățit cu poli-A) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/probă (în funcție de specie) | Raport de lungime totală>70% Scor mediu de calitate: Q10
|
Analize bioinformatice
●Prelucrarea datelor brute
● Identificarea transcriptului
● Îmbinare alternativă
● Cuantificarea expresiei la nivel de genă și la nivel de izoforme
● Analiza expresiei diferenţiale
● Adnotare și îmbogățire a funcției (DEG și DET)
Cerințe pentru mostre și livrare
Cerințe pentru eșantion:
Nucleotide:
| Conc. (ng/μl) | Cantitate (μg) | Puritate | Integritate |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Contaminare limitată sau lipsită de proteine sau ADN este indicată pe gel. | Pentru plante: RIN≥7,0; Pentru animale: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; creștere limitată sau inexistentă |
Țesut: Greutate (uscat): ≥1 g
*Pentru țesutul mai mic de 5 mg, vă recomandăm să trimiteți probă de țesut congelată rapid (în azot lichid).
Suspensie celulară: Număr de celule = 3×106- 1×107
*Recomandăm să expediați lizat de celule congelate.În cazul în care acea celulă numără mai puțin de 5×105, se recomandă congelarea rapidă în azot lichid, ceea ce este de preferat pentru micro extracție.
Probe de sânge: Volum≥1 ml
Livrare recomandată de mostre
Recipient: tub de centrifuga de 2 ml (nu este recomandata folie de cositor)
Etichetarea eșantionului: Grup+replicat de exemplu A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Expediere: 2, gheață carbonică: mostrele trebuie ambalate în saci și îngropate în gheață carbonică.
- Tuburi ARNstable: Probele de ARN pot fi uscate în tub de stabilizare a ARN (de exemplu, RNAstable®) și expediate la temperatura camerei.
Fluxul de lucru al serviciului
Nucleotide:
Livrare mostre
Construcția bibliotecii
Secvențierea
Analiza datelor
Servicii post-vânzare
Fluxul de lucru al serviciului
țesut:
Design experiment
Livrare mostre
extracția ARN
Construcția bibliotecii
Secvențierea
Analiza datelor
Servicii post-vânzare
1.Analiza expresiei diferențiale - Diagrama vulcanului
Analiza expresiei diferențiale poate fi procesată atât la nivel de genă pentru a identifica genele exprimate diferențial (DEG), cât și la nivel de izoforme pentru a identifica diferențial
transcrieri exprimate (DET)
2.Harta termică de grupare ierarhică
3. Identificare și clasificare alternativă a îmbinării
Cinci tipuri de evenimente alternative de îmbinare pot fi prezise de Astalavista.
4.Identificarea evenimentelor de poliadenilare alternativă (APA) și motiv la 50 bp în amonte de poli-A
Carcasa BMK
Identificare alternativă de îmbinare și cuantificare la nivel de izoforme prin secvențierea transcriptomului de lungime completă a nanoporilor
Publicat:Nature Communications, 2020
Strategia de secvențiere:
Grupare: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutaţie K700E);3. Celule B normale
Strategia de secvențiere: secvențierea bibliotecii MinION 2D, secvențierea bibliotecii PromethION 1D;date scurte de citire din aceleași mostre
Platformă de secvențiere: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Rezultate cheie
1. Identificare alternativă la nivel de izoformă
Secvențele de citire lungă permit identificarea mutantului SF3B1K700E-locurile de îmbinare modificate la nivel de izoforme.35 alternative 3′SS și 10 alternative 5′SS s-au dovedit a fi îmbinate diferențiat semnificativ între SF3B1K700Eși SF3B1WT.33 din cele 35 de modificări au fost descoperite recent prin secvențe de citire lungă.
2. Cuantificarea splicing alternativ la nivel de izoformă
Exprimarea izoformelor de retenție de intron (IR) în SF3B1K700Eși SF3B1WTau fost cuantificate pe baza secvențelor de nanopori, dezvăluind o reglare globală în jos a izoformelor IR în SF3B1K700E.
Referinţă
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Caracterizarea transcripției de lungime completă a mutației SF3B1 în leucemia limfocitară cronică dezvăluie reglarea în jos a intronilor reținuți [J].Comunicarea naturii.
