BMKCloud Log in
条形banner-03

Hua

Te Whakaraupapa mRNA-Nanopore

Ko te raupapa RNA he taputapu utu nui mo te tātaritanga tuhinga whanui.He pono, he maha nga whanaketanga nui i tutuki i te raupapa panui-poto tuku iho i konei.Heoi ano, he maha nga wa ka tutakina e ia nga herenga i roto i nga taatai ​​​​isoform roa-katoa, te inenga, te piro PCR.

Ko te raupapa Nanopore he rerekee mai i etahi atu papahanga raupapa, na te mea ka panui tika nga nucleotides me te kore te whakahiato DNA me te whakaputa panui roa ki te tekau kilobasase.Ma tenei ka whakamanahia te panui-a-waho ki te whakawhiti i nga tuhinga roa me te tarai i nga wero i roto i nga rangahau taumata-isoform.

PaerewaNanopore PromethION

Whare Pukapuka:cDNA-PCR


Nga Taipitopito Ratonga

Hua Whakaaturanga

Akoranga Take

Painga Ratonga

● rītaha raupapa iti

● Te whakaatu i nga ngota ngota cDNA roa-katoa

● He iti ake nga raraunga e hiahiatia ana kia rite te maha o nga tuhinga

● Te tautuhi i nga momo ahua maha mo ia ira

● Te inenga korero i roto i te taumata isoform

Whakatakotoranga Ratonga

Whare Pukapuka

Paerewa

Tukunga raraunga e manakohia ana (Gb)

Mana Kounga

cDNA-PCR(Poly-A whakarangatira)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/tauira (Kei runga i nga momo)

ōwehenga roa-katoa>70%

Te kaute kounga toharite: Q10

 

Ko nga rangahau bioinformatics

Tukatuka raraunga raw

● Tautuhi tuhinga

● Ko te hono atu

● Te inenga korero i te taumata ira me te taumata isoform

● Te tātari korero rerekee

● Tuhituhi mahi me te whakarangatira (DEG me DET)

 

roa tonu

Nga Whakaritenga Tauira me te Tukunga

Whakaritenga Tauira:

Nucleotides:

Conc.(ng/μl)

Rahi (μg)

Maamaa

Te tapatahi

≥ 100

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

He iti, karekau he pūmua, he poke DNA ranei e whakaatuhia ana i runga i te gel.

Mo nga tipu: RIN≥7.0;

Mo nga kararehe: RIN≥7.5;

5.0≥28S/18S≥1.0;

he iti, he kore ranei te taumata teitei

Kopa: Taumaha(maroke): ≥1 g

*Mo te kiko iti ake i te 5 mg, ka tūtohu kia tukuna mai he tauira kopa tio (i roto i te hau hauota wai).

Tārewa pūtau: Tatau pūtau = 3×106- 1×107

* Ka tūtohu matou ki te tuku lysate pūtau tio.Mena he iti ake te tatau o taua pūtau i te 5×105, ka tūtohuhia te flash tio i roto i te hauota wai, he pai ake mo te tangohanga moroiti.

Tauira toto: Volume≥1 ml

Tukunga Tauira Manakohia

Ipu: 2 ml ngongo centrifuge (Kāore i te tūtohutia te konumohe tine)

Tauira tapanga: Rōpū+whakaritea tauira A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Tukunga: 2, Tio-maroke: Me whakakii nga tauira ki roto i nga peeke ka tanu ki roto i te huka-maroke.

  1. Nga ngongo RNAstable: Ka taea te whakamaroke i nga tauira RNA i roto i te ngongo whakapumau RNA(hei tauira, RNAstable®) ka tukuna ki te pāmahana rūma.

 

Te Rerenga Mahi Ratonga

Nucleotides:

tuku tauira

Te tuku tauira

Te Whakaritenga Whare Pukapuka

Te hanga whare pukapuka

Whakaraupapa

Whakaraupapa

Te tātari raraunga

Te tātari raraunga

I muri i te hoko Ratonga

Nga ratonga muri-hoko

Te Rerenga Mahi Ratonga

Kopa:

Tauira QC

Hoahoa whakamatautau

tuku tauira

Te tuku tauira

Whakamatau pairati

tangohanga RNA

Te Whakaritenga Whare Pukapuka

Te hanga whare pukapuka

Whakaraupapa

Whakaraupapa

Te tātari raraunga

Te tātari raraunga

I muri i te hoko Ratonga

Nga ratonga muri-hoko


  • Tōmua:
  • Panuku:

  • 1.Te wetewete korero rereke -Te puia puia

    Ka taea te tukatuka i te wetewete korero rerekee i roto i nga taumata ira e rua hei tautuhi i nga ira rerekee (DEG) me te taumata isoform hei tautuhi rerekee.

     3(1)

    tuhinga tuhi (DET) 

    2.Mahere wera whakarōpūtanga aroākapa

    4(1)

    3.Alternative splicing identification and classification

    E rima nga momo o nga huihuinga honohono rereke ka taea e Astalavista te matapae.

    5(1)

    4.Ko etahi atu takahanga poly-adenylation (APA) te tautuhi me te Motif i te 50 bp whakarunga o te poly-A

    6(1)

    Take BMK

    Ko te tautuhi taapiri rereke me te ine taumata-isoform ma te nanopore raupapa tuhinga roa-katoa

    Whakaputaina:Whakawhitiwhiti Nature,2020

    Rautaki raupapa:

    Whakarōpū: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E whakarerekētanga);3. Pūtau B noa

    Rautaki raupapa: Te raupapatanga whare pukapuka MinION 2D, PromethION 1D raupapa pukapuka;nga raraunga panui poto mai i nga tauira ano

    Te raupapa raupapa: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;

    Nga hua matua

    1.Isoform-level Alternative Splicing Identification

    Ko nga raupapa panui-roa ka whakamanahia te tautuhi i te mutant SF3B1K700E-i whakarereke i nga waahi hono i te taumata-isoform.E 35 nga momo 3'SS me te 10 nga momo 5'SS i kitea he tino rereke te hono i waenga i te SF3B1K700Eme te SF3B1WT.33 o nga whakarereketanga 35 i kitea hou e nga raupapa panui-roa.

    2.Isoform-level Alternative Splicing quantification

    Whakaaturanga o te pupuri intron(IR) isoforms i SF3B1K700Eme te SF3B1WTi inehia i runga i nga raupapa nanopore, e whakaatu ana i te ture-a-ao mo nga IR isoforms i SF3B1K700E.

    Tohutoro

    Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Ko te ahua o te tuhinga roa mo te whakarereketanga o te SF3B1 i roto i te leukemia lymphocytic tawhito e whakaatu ana i te whakahekenga o nga introns [J].Whakawhitiwhiti Nature.

    whiwhi korero

    Tuhia to korero ki konei ka tukuna mai ki a matou

    Tukuna mai to korero ki a matou: