Sequencing mRNA Panjang Penuh-Nanopore
Keunggulan Layanan
● Bias urutan rendah
● Mengungkap molekul cDNA ukuran penuh
● Lebih sedikit data yang diperlukan untuk mencakup jumlah transkrip yang sama
● Identifikasi beberapa isoform per gen
● Kuantifikasi ekspresi pada level isoform
Spesifikasi Layanan
| Perpustakaan | Platform | Hasil data yang disarankan (Gb) | Kontrol kualitas |
| cDNA-PCR (diperkaya Poli-A) | Nanopore Prometion P48 | 6 Gb/sampel (Tergantung spesies) | Rasio panjang penuh＞70% Skor kualitas rata-rata: Q10
|
Analisis bioinformatika
●Pemrosesan data mentah
● Identifikasi transkrip
● Penyambungan alternatif
● Kuantifikasi ekspresi pada tingkat gen dan tingkat isoform
● Analisis ekspresi diferensial
● Anotasi dan pengayaan fungsi (DEG dan DET)
Persyaratan Sampel dan Pengiriman
Persyaratan Sampel:
Nukleotida:
| Konsentrasi (ng/μl) | Jumlah (μg) | Kemurnian | Integritas |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Kontaminasi protein atau DNA terbatas atau tidak ada pada gel. | Untuk tanaman: RIN≥7.0; Untuk hewan: RIN≥7.5; 5,0≥28S/18S≥1,0; elevasi dasar yang terbatas atau tidak ada sama sekali |
Jaringan: Berat (kering): ≥1 g
*Untuk jaringan yang lebih kecil dari 5 mg, kami menyarankan untuk mengirimkan sampel jaringan beku (dalam nitrogen cair).
Suspensi sel: Jumlah sel = 3×106- 1×107
*Kami menyarankan untuk mengirimkan lisat sel beku.Jika jumlah sel tersebut lebih kecil dari 5×105, direkomendasikan untuk dibekukan dalam nitrogen cair, yang lebih disukai untuk ekstraksi mikro.
Sampel darah: Volume≥1 ml
Pengiriman Sampel yang Direkomendasikan
Wadah: tabung centrifuge 2 ml (tidak disarankan menggunakan kertas timah)
Contoh pelabelan: Grup+replikasi misalnya A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Pengiriman: 2、Es kering: Sampel harus dikemas dalam tas dan dikubur dalam es kering.
- Tabung RNAstabil: Sampel RNA dapat dikeringkan dalam tabung stabilisasi RNA (misalnya RNAstable®) dan dikirim dalam suhu kamar.
Alur Kerja Layanan
Nukleotida:
Pengiriman sampel
Pembangunan perpustakaan
Pengurutan
Analisis data
Layanan purna jual
Alur Kerja Layanan
Jaringan:
Desain percobaan
Pengiriman sampel
Ekstraksi RNA
Pembangunan perpustakaan
Pengurutan
Analisis data
Layanan purna jual
1.Analisis ekspresi diferensial -Plot gunung berapi
Analisis ekspresi diferensial dapat diproses pada tingkat gen untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) dan pada tingkat isoform untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda.
transkrip yang diungkapkan (DET)
2.Peta panas pengelompokan hierarki
3. Identifikasi dan klasifikasi penyambungan alternatif
Lima jenis kejadian penyambungan alternatif dapat diprediksi oleh Astalavista.
4.Identifikasi peristiwa dan Motif poli-adenilasi alternatif (APA) pada 50 bp hulu poli-A
Kasus BMK
Identifikasi penyambungan alternatif dan kuantifikasi tingkat isoform dengan pengurutan transkriptome panjang penuh nanopore
Diterbitkan:Komunikasi Alam,2020
Strategi pengurutan:
Pengelompokan: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutasi K700E);3. Sel B normal
Strategi pengurutan: pengurutan pustaka MinION 2D, pengurutan pustaka PromethION 1D;data baca singkat dari sampel yang sama
Platform pengurutan: Nanopore MinION;Prometion Nanopore;
Hasil utama
1. Identifikasi Penyambungan Alternatif Tingkat Isoform
Urutan baca yang panjang memberdayakan identifikasi SF3B1 mutanK700E-situs sambungan yang diubah pada tingkat isoform.35 alternatif 3′SS dan 10 alternatif 5′SS ditemukan berbeda secara signifikan disambung antara SF3B1K700Edan SF3B1WT.33 dari 35 perubahan baru ditemukan melalui rangkaian yang telah lama dibaca.
2. Kuantifikasi Penyambungan Alternatif Tingkat Isoform
Ekspresi isoform retensi intron (IR) di SF3B1K700Edan SF3B1WTdikuantifikasi berdasarkan urutan nanopore, mengungkapkan penurunan regulasi global isoform IR di SF3B1K700E.
Referensi
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, dkk.Karakterisasi transkrip lengkap mutasi SF3B1 pada leukemia limfositik kronis menunjukkan penurunan regulasi intron yang tertahan [J].Komunikasi Alam.
