Mga produkto

Full-Length mRNA Sequencing-Nanopore

Ang RNA sequencing ay naging isang napakahalagang tool para sa komprehensibong pagsusuri ng transcriptome.Walang alinlangan, nakamit ng tradisyonal na short-read sequencing ang maraming mahalagang pag-unlad dito.Gayunpaman, madalas itong nakatagpo ng mga limitasyon sa buong haba ng mga pagkakakilanlan ng isoform, dami, bias ng PCR.

Ang pagkakasunud-sunod ng nanopore ay nakikilala ang sarili nito mula sa iba pang mga platform ng pagkakasunud-sunod, dahil ang mga nucleotide ay direktang binabasa nang walang synthesis ng DNA at bumubuo ng mahabang pagbasa sa sampu-sampung kilobases.Nagbibigay ito ng kapangyarihan sa direktang read-out na pagtawid sa mga full-length na transcript at pagharap sa mga hamon sa mga pag-aaral sa antas ng isoform.

Platform：Nanopore PromethION

Library:cDNA-PCR

Makipag-ugnayan sa amin

Mga Detalye ng Serbisyo

Mga Resulta ng Demo

Pag-aaral ng Kaso

Mga Kalamangan sa Serbisyo

● Mababang sequence bias

● Pagbubunyag ng mga full-length na molekula ng cDNA

● Mas kaunting data ang kinakailangan upang masakop ang parehong bilang ng mga transcript

● Pagkilala sa maraming isoform bawat gene

● Ang dami ng ekspresyon sa antas ng isoform

Mga Detalye ng Serbisyo

Aklatan

Platform

Inirerekomendang ani ng data (Gb)

Quality Control

cDNA-PCR(Poly-A enriched)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/sample (Depende sa species)

Full-length ratio＞70%

Average na marka ng kalidad: Q10

Pagsusuri ng bioinformatics

●Pagproseso ng raw data

● Transcript identification

● Alternatibong splicing

● Pagbibilang ng ekspresyon sa antas ng gene at antas ng isoform

● Pagsusuri ng differential expression

● Function annotation at enrichment (DEGs at DETs)

Mga Sample na Kinakailangan at Paghahatid

Mga Sample na Kinakailangan:

Nucleotides:

Conc.(ng/μl)

Halaga (μg)

Kadalisayan

Integridad

≥ 100

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

Limitado o walang protina o kontaminasyon ng DNA na ipinapakita sa gel.

Para sa mga halaman: RIN≥7.0;

Para sa mga hayop: RIN≥7.5;

5.0≥28S/18S≥1.0;

limitado o walang baseline elevation

Tissue: Timbang(tuyo): ≥1 g

*Para sa tissue na mas maliit sa 5 mg, inirerekomenda naming magpadala ng flash frozen(sa liquid nitrogen) sample ng tissue.

Pagsuspinde ng cell: Bilang ng cell = 3×10⁶- 1×10⁷

*Inirerekomenda naming ipadala ang frozen cell lysate.Kung sakaling mas maliit ang cell na iyon sa 5×10⁵, inirerekomenda ang flash frozen sa liquid nitrogen, na mas mainam para sa micro extraction.

Mga sample ng dugo: Dami≥1 ml

Inirerekomendang Paghahatid ng Sample

Lalagyan: 2 ml centrifuge tube (Hindi inirerekomenda ang tin foil)

Sample na pag-label: Pangkat+kopya hal. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Pagpapadala: 2, Dry-ice: Ang mga sample ay kailangang ilagay sa mga bag at ibaon sa dry-ice.

Mga RNAstable na tubo: Ang mga sample ng RNA ay maaaring patuyuin sa RNA stabilization tube (hal. RNAstable®) at ipadala sa temperatura ng silid.

Daloy ng Trabaho ng Serbisyo

Nucleotides:

Paghahatid ng sample

Paggawa ng aklatan

Pagsusunod-sunod

Pagsusuri sa datos

Mga serbisyo pagkatapos ng pagbebenta

Daloy ng Trabaho ng Serbisyo

Tissue:

Eksperimento na disenyo

Paghahatid ng sample

Pagkuha ng RNA

Paggawa ng aklatan

Pagsusunod-sunod

Pagsusuri sa datos

Mga serbisyo pagkatapos ng pagbebenta

Nakaraan: Full-length mRNA sequencing -PacBio

Susunod: 10x Genomics Visium Spatial Transcriptome

1.Pagsusuri ng differential expression -Plot ng bulkan

Ang pagsusuri sa pagkakaiba-iba ng expression ay maaaring iproseso sa parehong antas ng gene upang matukoy ang mga differentially expressed genes (DEGs) at sa antas ng isoform upang makilala nang naiiba.

3(1)

expressed transcripts (DETs)

2.Hierarchical clustering heatmap

3. Alternatibong pagkakakilanlan at pag-uuri ng splicing

Limang uri ng alternatibong splicing na kaganapan ang maaaring hulaan ng Astalavista.

4.Alternatibong poly-adenylation (APA) na pagkilala sa mga kaganapan at Motif sa 50 bp upstream ng poly-A

Kaso ng BMK

Alternatibong splicing identification at isoform-level quantification sa pamamagitan ng nanopore full-length transcriptome sequencing

Nai-publish:Komunikasyon ng Kalikasan,2020

Diskarte sa pagkakasunud-sunod:

Pagpapangkat: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(K700E mutation);3. Mga normal na B-cell

Diskarte sa sequencing: MiniON 2D library sequencing, PromethION 1D library sequencing;maikling-read na data mula sa parehong mga sample

Sequencing platform: Nanopore Minion;Nanopore PromethION;

Mga pangunahing resulta

1.Isoform-level na Alternative Splicing Identification

Binibigyang-daan ng mga long-read sequence ang pagkilala sa mutant SF3B1^K700E-binago ang mga site ng splice sa antas ng isoform.35 alternatibong 3′SSs at 10 alternatibong 5′SSs ay natagpuan na may makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng SF3B1^K700Eat SF3B1^WT.33 sa 35 na pagbabago ay bagong natuklasan ng matagal nang nabasa na mga pagkakasunud-sunod.

2.Isoform-level Alternative Splicing quantification

Pagpapahayag ng mga intron retention(IR) isoform sa SF3B1^K700Eat SF3B1^WTay binibilang batay sa mga pagkakasunud-sunod ng nanopore, na nagpapakita ng isang pandaigdigang down-regulation ng IR isoforms sa SF3B1^K700E.

Sanggunian

Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Ang buong-haba na transcript characterization ng SF3B1 mutation sa talamak na lymphocytic leukemia ay nagpapakita ng downregulation ng mga napanatili na intron [J].Komunikasyon sa Kalikasan.