ການຈັດລໍາດັບພັນທຸກໍາຂອງພືດ/ສັດ De Novo
ເດີ ໂນໂວການຈັດລຳດັບໝາຍເຖິງການສ້າງຈີໂນມທັງໝົດຂອງຊະນິດພັນໂດຍໃຊ້ເຕັກໂນໂລຊີການຈັດລຳດັບໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີຈີໂນມອ້າງອີງ. ການນຳສະເໜີ ແລະ ການຮັບຮອງເອົາຢ່າງກວ້າງຂວາງຂອງການຈັດລຳດັບລຸ້ນທີສາມ, ເຊິ່ງມີການອ່ານທີ່ຍາວກວ່າ, ໄດ້ເສີມຂະຫຍາຍການປະກອບຈີໂນມຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍການເພີ່ມການຊ້ອນກັນລະຫວ່າງການອ່ານ. ການປັບປຸງນີ້ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງໂດຍສະເພາະເມື່ອຈັດການກັບຈີໂນມທີ່ທ້າທາຍ, ເຊັ່ນວ່າຜູ້ທີ່ມີ heterozygosity ສູງ, ອັດຕາສ່ວນສູງຂອງພາກພື້ນທີ່ຊ້ຳກັນ, polyploid, ແລະ ພາກພື້ນທີ່ມີອົງປະກອບທີ່ຊ້ຳກັນ, ເນື້ອໃນ GC ຜິດປົກກະຕິ, ຫຼື ຄວາມສັບສົນສູງທີ່ປົກກະຕິແລ້ວຈະປະກອບບໍ່ດີໂດຍໃຊ້ການຈັດລຳດັບທີ່ອ່ານສັ້ນພຽງຢ່າງດຽວ.
ວິທີແກ້ໄຂແບບຄົບວົງຈອນຂອງພວກເຮົາໃຫ້ບໍລິການຈັດລຳດັບແບບປະສົມປະສານ ແລະ ການວິເຄາະຊີວະຂໍ້ມູນຂ່າວສານທີ່ສົ່ງມອບຈີໂນມທີ່ປະກອບໃໝ່ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງ. ການສຳຫຼວດຈີໂນມເບື້ອງຕົ້ນກັບ Illumina ໃຫ້ການປະເມີນຂະໜາດ ແລະ ຄວາມຊັບຊ້ອນຂອງຈີໂນມ, ແລະ ຂໍ້ມູນນີ້ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອນຳພາຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປຂອງການຈັດລຳດັບແບບອ່ານຍາວດ້ວຍ PacBio HiFi, ຕາມດ້ວຍເດີໂນໂວການປະກອບຂອງ contigs. ການນໍາໃຊ້ HiC assembly ຕໍ່ມາຊ່ວຍໃຫ້ສາມາດຍຶດ contigs ກັບ genome, ໄດ້ຮັບການປະກອບລະດັບໂຄຣໂມໂຊມ. ສຸດທ້າຍ, genome ແມ່ນຖືກອະທິບາຍໂດຍການຄາດຄະເນ gene ແລະໂດຍການຈັດລໍາດັບ gene ທີ່ສະແດງອອກ, ໂດຍການນໍາໃຊ້ transcriptomes ທີ່ມີການອ່ານສັ້ນ ແລະ ຍາວ.
ຄຸນສົມບັດການບໍລິການ
● ການເຊື່ອມໂຍງການບໍລິການລຳດັບຫຼາຍອັນ ແລະ ຊີວະຂໍ້ມູນຂ່າວສານໃນວິທີແກ້ໄຂແບບປະຕູດຽວ:
ການສຳຫຼວດຈີໂນມດ້ວຍ Illumina ເພື່ອປະເມີນຂະໜາດຈີໂນມ ແລະ ນຳພາຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປ;
ການຈັດລຳດັບການອ່ານຍາວສຳລັບເດີໂນໂວການຊຸມນຸມຂອງ contigs;
ການຈັດລຳດັບ Hi-C ສຳລັບການຍຶດໂຄໂມໂຊມ;
ການຈັດລຳດັບ mRNA ສຳລັບການໝາຍເຫດຂອງຍີນ;
ການຢືນຢັນການປະກອບ.
● ການບໍລິການທີ່ເໝາະສົມສຳລັບການສ້າງຈີໂນມໃໝ່ ຫຼື ການປັບປຸງຈີໂນມອ້າງອີງທີ່ມີຢູ່ແລ້ວສຳລັບຊະນິດພັນທີ່ສົນໃຈ.
ຂໍ້ໄດ້ປຽບຂອງການບໍລິການ
ການພັດທະນາເວທີການຈັດລຽງລໍາດັບ ແລະ ຊີວະຂໍ້ມູນຂ່າວສານໃນເດີໂນໂວການປະກອບຈີໂນມ
(Amarasinghe SL ແລະ ອື່ນໆ,ຊີວະວິທະຍາຂອງຈີໂນມ, 2020)
●ຄວາມຊ່ຽວຊານຢ່າງກວ້າງຂວາງ ແລະ ບັນທຶກການພິມເຜີຍແຜ່BMKGene ໄດ້ສະສົມປະສົບການອັນໃຫຍ່ຫຼວງໃນການປະກອບຈີໂນມທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງຂອງຊະນິດພັນທີ່ຫຼາກຫຼາຍ, ລວມທັງຈີໂນມໄດພລອຍ ແລະ ຈີໂນມທີ່ສັບສົນສູງຂອງຊະນິດພັນໂພລີພລອຍ ແລະ ອາໂລໂພລີພລອຍ. ນັບຕັ້ງແຕ່ປີ 2018, ພວກເຮົາໄດ້ປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນຫຼາຍກວ່າສິ່ງພິມທີ່ມີຜົນກະທົບສູງ 300 ສະບັບ, ແລະຫຼາຍກວ່າ 20 ສະບັບໄດ້ຖືກຕີພິມໃນ Nature Genetics.
● ວິທີແກ້ໄຂແບບຄົບວົງຈອນວິທີການປະສົມປະສານຂອງພວກເຮົາລວມເອົາເຕັກໂນໂລຊີການຈັດລໍາດັບຫຼາຍຢ່າງ ແລະ ການວິເຄາະທາງຊີວະຂໍ້ມູນຂ່າວສານເຂົ້າໃນຂະບວນການເຮັດວຽກທີ່ສອດຄ່ອງກັນ, ເຊິ່ງສົ່ງມອບຈີໂນມທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງ.
●ປັບແຕ່ງໃຫ້ເໝາະສົມກັບຄວາມຕ້ອງການຂອງທ່ານຂະບວນການເຮັດວຽກບໍລິການຂອງພວກເຮົາສາມາດປັບແຕ່ງໄດ້, ຊ່ວຍໃຫ້ສາມາດປັບຕົວໄດ້ສຳລັບຈີໂນມທີ່ມີຄຸນສົມບັດທີ່ຫຼາກຫຼາຍ ແລະ ຄວາມຕ້ອງການດ້ານການຄົ້ນຄວ້າສະເພາະ. ນີ້ລວມມີການຮອງຮັບຈີໂນມຍັກ, ຈີໂນມໂພລີພລອຍ, ຈີໂນມທີ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນສູງ, ແລະ ອື່ນໆ.
●ທີມງານຊີວະວິທະຍາຂໍ້ມູນຂ່າວສານ ແລະ ຫ້ອງທົດລອງທີ່ມີທັກສະສູງມີປະສົບການອັນຍິ່ງໃຫຍ່ທັງໃນດ້ານການທົດລອງ ແລະ ຊີວະຂໍ້ມູນຂ່າວສານຂອງການປະກອບຈີໂນມທີ່ສັບສົນ ພ້ອມທັງສິດທິບັດ ແລະ ລິຂະສິດຊອບແວຫຼາຍສະບັບ.
●ການສະໜັບສະໜູນຫຼັງການຂາຍ:ຄຳໝັ້ນສັນຍາຂອງພວກເຮົາຍັງຂະຫຍາຍໄປໄກກວ່າການສຳເລັດໂຄງການດ້ວຍໄລຍະເວລາການບໍລິການຫຼັງການຂາຍ 3 ເດືອນ. ໃນລະຫວ່າງເວລານີ້, ພວກເຮົາສະເໜີການຕິດຕາມໂຄງການ, ການຊ່ວຍເຫຼືອໃນການແກ້ໄຂບັນຫາ, ແລະ ກອງປະຊຸມຖາມ-ຕອບ ເພື່ອແກ້ໄຂຄຳຖາມຕ່າງໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບ.
ລາຍລະອຽດການບໍລິການ
| ການສຳຫຼວດຈີໂນມ | ການປະກອບຈີໂນມ | ລະດັບໂຄຣໂມໂຊມ | ຄຳອະທິບາຍກ່ຽວກັບຈີໂນມ |
| 50X Illumina NovaSeq PE150
| ການອ່ານ PacBio CCS HiFi 30X | 100X Hi-C | RNA-seq Illumina PE150 10 Gb + (ບໍ່ຈຳເປັນ) RNA-seq ຄວາມຍາວເຕັມ PacBio 40 Gb ຫຼື ນາໂນພອຣ໌ 12 Gb |
ຂໍ້ກຳນົດການບໍລິການ
ສຳລັບການສຳຫຼວດຈີໂນມ, ການປະກອບຈີໂນມ ແລະ ການປະກອບ Hi-C:
| ເນື້ອເຍື່ອ ຫຼື ກົດນິວເຄຼຍອິກທີ່ສະກັດອອກມາ | ການສຳຫຼວດຈີໂນມ | ການປະກອບຈີໂນມດ້ວຍ PacBio | ການປະກອບ Hi-C |
| ອະໄວຍະວະພາຍໃນສັດ | ≥ 0.2 ກຣາມ
| ≥ 1 ກຣາມ | ≥ 1 ກຣາມ |
| ກ້າມຊີ້ນສັດ | |||
| ເລືອດຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ | ≥ 0.3 ມລ | ≥ 1 ມລ | ≥ 2 ມລ |
| ເລືອດສັດປີກ/ປາ | ≥ 0.05 ມລ | ≥ 0.1 ມລ | |
| ພືດ - ໃບສົດ | ≥ 0.5 ກຣາມ | ≥ 2 ກຣາມ | ≥ 2 ກຣາມ |
| ຈຸລັງທີ່เพาะเลี้ยง | ≥ 1x106 | ≥ 5x106 | ≥ 1x107 |
| ແມງໄມ້ | ≥ 0.2 ກຣາມ | ≥ 1 ກຣາມ | ≥ 1 ກຣາມ |
| ສິ່ງມີຊີວິດໃນນ້ຳ - ເນື້ອເຍື່ອກ້າມຊີ້ນ | ≥ 0.3 ກຣາມ | ≥ 1.5 ກຣາມ | ≥ 1.0 ກຣາມ |
| ສິ່ງມີຊີວິດໃນນ້ຳ - ສາຫຼ່າຍ | ≥ 0.5 ກຣາມ | ≥ 3.0 ກຣາມ | ≥ 2.0 ກຣາມ |
| DNA ທີ່ສະກັດອອກມາ | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ≥1 ng/µL ປະລິມານ ≥ 30 ng ຈຳກັດ ຫຼື ບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມ ຫຼື ການປົນເປື້ອນ | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ≥ 50 ng/µL ປະລິມານ: 8 µg/ຈຸລັງໄຫຼ/ຕົວຢ່າງ OD260/280=1.7-2.2 OD260/230=1.8-2.5 ຈຳກັດ ຫຼື ບໍ່ມີການເຊື່ອມໂຊມ ຫຼື ການປົນເປື້ອນ |
-
|
ສຳລັບຄຳບັນຍາຍຂອງຈີໂນມດ້ວຍ transcriptomics:
| ເນື້ອເຍື່ອ ຫຼື ກົດນິວເຄຼຍອິກທີ່ສະກັດອອກມາ | ບົດບັນທຶກສຽງຂອງ Illumina | ບົດບັນທຶກສຽງ PacBio | ການຖອດລະຫັດໂພຣນາໂນ |
| ພືດ - ຮາກ/ລຳຕົ້ນ/ກີບດອກ | 450 ມກ | 600 ມກ | |
| ພືດ - ໃບ/ແກ່ນ | 300 ມກ | 300 ມກ | |
| ພືດ - ໝາກໄມ້ | 1.2 ກຣາມ | 1.2 ກຣາມ | |
| ຫົວໃຈ/ລຳໄສ້ສັດ | 300 ມກ | 300 ມກ | |
| ອະໄວຍະວະ/ສະໝອງຂອງສັດ | 240 ມກ | 240 ມກ | |
| ກ້າມຊີ້ນສັດ | 450 ມກ | 450 ມກ | |
| ກະດູກ/ຜົມ/ຜິວໜັງສັດ | 1 ກຣາມ | 1 ກຣາມ | |
| ແມງໄມ້ - ແມງໄມ້ | 6 | 6 | |
| ສັດອາໂຕຣໂປດ - ສັດປະເພດກຸ້ງ | 300 ມກ | 300 ມກ | |
| ເລືອດທັງໝົດ | 1 ທໍ່ | 1 ທໍ່ | |
| RNA ທີ່ສະກັດອອກມາ | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ≥ 20 ng/µL ປະລິມານ ≥ 0.3 µg OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ຣິນ≥ 6 5≥28S/18S≥1 | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ≥ 100 ng / µL ປະລິມານ ≥ 1 µg OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ຣິນ≥ 8 5≥28S/18S≥1 | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ≥ 100 ng / µL ປະລິມານ ≥ 1 µg OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 ຣິນ≥ 7.5 5≥28S/18S≥1 |
ການຈັດສົ່ງຕົວຢ່າງທີ່ແນະນຳ
ພາຊະນະ: ທໍ່ centrifuge 2 ມລ (ບໍ່ແນະນຳໃຫ້ໃຊ້ຟອຍກົ່ວ)
(ສຳລັບຕົວຢ່າງສ່ວນໃຫຍ່, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ບໍ່ໃຫ້ເກັບໄວ້ໃນເອທານອນ.)
ການຕິດສະຫຼາກຕົວຢ່າງ: ຕົວຢ່າງຕ້ອງມີການຕິດສະຫຼາກຢ່າງຊັດເຈນ ແລະ ຄືກັນກັບແບບຟອມຂໍ້ມູນຕົວຢ່າງທີ່ສົ່ງມາ.
ການຂົນສົ່ງ: ນ້ຳກ້ອນແຫ້ງ: ຕົວຢ່າງຕ້ອງໄດ້ບັນຈຸໃສ່ຖົງກ່ອນ ແລະ ຝັງໄວ້ໃນນ້ຳກ້ອນແຫ້ງ.
ຂັ້ນຕອນການເຮັດວຽກ
ຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງການບໍລິການ
ການອອກແບບການທົດລອງ
ການຈັດສົ່ງຕົວຢ່າງ
ການສະກັດເອົາ DNA
ການກໍ່ສ້າງຫໍສະໝຸດ
ການຈັດລຳດັບ
ການວິເຄາະຂໍ້ມູນ
ບໍລິການຫຼັງການຂາຍ
ການວິເຄາະຊີວະຂໍ້ມູນຂ່າວສານທີ່ສົມບູນ, ແຍກອອກເປັນ 4 ຂັ້ນຕອນຄື:
1) ການສຳຫຼວດຈີໂນມ, ໂດຍອີງໃສ່ການວິເຄາະ k-mer ດ້ວຍ NGS ອ່ານວ່າ:
ການປະເມີນຂະໜາດຂອງຈີໂນມ
ການປະເມີນ heterozygosity
ການປະເມີນພາກພື້ນທີ່ຊໍ້າຊ້ອນ
2) ການປະກອບຈີໂນມດ້ວຍ PacBio HiFi:
ເດີໂນໂວການປະກອບ
ການປະເມີນການປະກອບ: ລວມທັງການວິເຄາະ BUSCO ສຳລັບຄວາມຄົບຖ້ວນຂອງຈີໂນມ ແລະ ການສ້າງແຜນທີ່ດ້ານຫຼັງຂອງການອ່ານ NGS ແລະ PacBio HiFi
3) ການປະກອບ Hi-C:
QC ຂອງຫ້ອງສະໝຸດ Hi-C: ການປະເມີນການພົວພັນ Hi-C ທີ່ຖືກຕ້ອງ
ການປະກອບ Hi-C: ການຈັດກຸ່ມຂອງ contig ເປັນກຸ່ມ, ຕາມດ້ວຍການຈັດລຽງ contig ພາຍໃນແຕ່ລະກຸ່ມ ແລະ ການກຳນົດທິດທາງ contig
ການປະເມີນຜົນ Hi-C
4) ຄຳອະທິບາຍກ່ຽວກັບຈີໂນມ:
ການຄາດຄະເນ RNA ທີ່ບໍ່ມີລະຫັດ
ການລະບຸລຳດັບຊ້ຳໆ (transposons ແລະ tandem repeats)
ການຄາດຄະເນຂອງຍີນ
§ເດີໂນໂວ: ອັລກໍຣິທຶມ ab initio
§ ອີງໃສ່ຄວາມຄ້າຍຄືກັນ
§ ອີງຕາມບົດບັນທຶກ, ດ້ວຍການອ່ານຍາວ ແລະ ສັ້ນ: ການອ່ານແມ່ນເດີໂນໂວປະກອບ ຫຼື ເຊື່ອມໂຍງເຂົ້າກັບຈີໂນມຮ່າງ
§ ຄຳອະທິບາຍຂອງ genes ທີ່ຄາດຄະເນດ້ວຍຖານຂໍ້ມູນຫຼາຍອັນ
1) ການສຳຫຼວດຈີໂນມ - ການວິເຄາະ k-mer
2) ການປະກອບຈີໂນມ
2) ການປະກອບຈີໂນມ - PacBio HiFi ອ່ານການສ້າງແຜນທີ່ໄປຫາຮ່າງການປະກອບ
2) ການປະກອບ Hi-C - ການປະເມີນຄູ່ປະຕິສຳພັນທີ່ຖືກຕ້ອງຂອງ Hi-C
3) ການປະເມີນຜົນຫຼັງການປະກອບ Hi-C
4) ຄຳອະທິບາຍກ່ຽວກັບຈີໂນມ - ການເຊື່ອມໂຍງຂອງຈີໂນມທີ່ຄາດຄະເນໄວ້
4) ຄຳບັນຍາຍກ່ຽວກັບຈີໂນມ - ຄຳບັນຍາຍກ່ຽວກັບຈີໂນມທີ່ຄາດຄະເນໄວ້
ສຳຫຼວດຄວາມກ້າວໜ້າທີ່ໄດ້ຮັບການຊ່ວຍເຫຼືອຈາກການບໍລິການປະກອບຈີໂນມແບບໃໝ່ຂອງ BMKGene ຜ່ານການລວບລວມສິ່ງພິມທີ່ຄັດສັນມາอย่างดี:
Li, C. ແລະ ອື່ນໆ. (2021) 'ລຳດັບຈີໂນມເປີດເຜີຍເສັ້ນທາງການແຜ່ກະຈາຍທົ່ວໂລກ ແລະ ແນະນຳການປັບຕົວທາງພັນທຸກຳທີ່ລວມເຂົ້າກັນໃນວິວັດທະນາການຂອງມ້ານ້ຳ', Nature Communications, 12(1). doi: 10.1038/S41467-021-21379-X.
Li, Y. ແລະ ອື່ນໆ. (2023) 'ການປ່ຽນແປງຂອງໂຄຣໂມໂຊມຂະໜາດໃຫຍ່ນຳໄປສູ່ການປ່ຽນແປງການສະແດງອອກໃນລະດັບຈີໂນມ, ການປັບຕົວຂອງສິ່ງແວດລ້ອມ, ແລະ ການຈຳແນກຊະນິດໃນ Gayal (Bos frontalis)', ຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນ ແລະ ວິວັດທະນາການ, 40(1). doi: 10.1093/MOLBEV/MSAD006.
Tian, T. ແລະ ອື່ນໆ (2023) 'ການປະກອບຈີໂນມ ແລະ ການຕັດແຍກພັນທຸກໍາຂອງເຊື້ອພັນສາລີທີ່ທົນທານຕໍ່ໄພແຫ້ງແລ້ງທີ່ໂດດເດັ່ນ', Nature Genetics 2023 55:3, 55(3), ໜ້າ 496–506. doi: 10.1038/s41588-023-01297-y.
Zhang, F. ແລະ ອື່ນໆ (2023) 'ເປີດເຜີຍວິວັດທະນາການຂອງການສັງເຄາະທາງຊີວະພາບຂອງອາລຄາລອຍ tropane ໂດຍການວິເຄາະສອງຈີໂນມໃນຄອບຄົວ Solanaceae', Nature Communications 2023 14:1, 14(1), ໜ້າ 1–18. doi: 10.1038/s41467-023-37133-4.
ກໍລະນີສຶກສາທີ່ທ້າທາຍ:
ການປະກອບຕົວລະຫວ່າງເທໂລເມຍກັບເທໂລເມຍ:Fu, A. ແລະ ອື່ນໆ. (2023) 'ການປະກອບຈີໂນມ Telomere-to-telomere ຂອງໝາກໂມຂົມ (Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.) ເປີດເຜີຍການພັດທະນາໝາກໄມ້, ສ່ວນປະກອບ ແລະ ລັກສະນະທາງພັນທຸກໍາຂອງການສຸກ', ການຄົ້ນຄວ້າດ້ານພືດສວນ, 10(1). doi: 10.1093/HR/UHAC228.
ການປະກອບຮາໂປໄທບ໌:Hu, W. ແລະ ອື່ນໆ. (2021) 'ຈີໂນມທີ່ກຳນົດໂດຍອາລີນສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງທາງພັນທຸກໍາໃນລະຫວ່າງການວິວັດທະນາການຂອງມັນຕົ້ນ', Molecular Plant, 14(6), ໜ້າ 851–854. doi: 10.1016/j.molp.2021.04.009.
ການປະກອບຈີໂນມຍັກໃຫຍ່:Yuan, J. ແລະ ອື່ນໆ (2022) 'ພື້ນຖານທາງຈີໂນມຂອງ giga-chromosomes ແລະ giga-genome ຂອງດອກ peony ຕົ້ນໄມ້ Paeonia ostii', Nature Communications 2022 13:1, 13(1), ໜ້າ 1–16. doi: 10.1038/s41467-022-35063-1.
ການປະກອບຈີໂນມໂພລີພລອຍ:Zhang, Q. ແລະ ອື່ນໆ. (2022) 'ຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບຈີໂນມກ່ຽວກັບການຫຼຸດຜ່ອນໂຄໂມໂຊມທີ່ຜ່ານມາຂອງອ້ອຍ autopolyploid Saccharum spontaneum', Nature Genetics 2022 54:6, 54(6), ໜ້າ 885–896. doi: 10.1038/s41588-022-01084-1.
