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Sequenciamento longo não codificado-Illumina

RNAs não codificantes longos (lncRNAs) são um tipo de moléculas de RNA com comprimento superior a 200 nt, que são caracterizados por um potencial de codificação extremamente baixo.O LncRNA, como membro chave nos RNAs não codificantes, é encontrado principalmente no núcleo e no plasma.O desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento e da bioinformática permite a identificação de numerosos novos lncRNAs e associá-los a funções biológicas.Evidências acumulativas sugerem que o lncRNA está amplamente envolvido na regulação epigenética, na regulação da transcrição e na regulação pós-transcrição.


Detalhes do serviço

Bioinformática

Resultados de demonstração

Estudo de caso

Vantagens do serviço

● Vantagens do serviço

● Específico de células e tecidos

● Estágio específico expressa e apresenta mudança de expressão dinâmica

● Padrões precisos de expressão de tempo e espaço

● Análise conjunta com dados de mRNA.

● Entrega de resultados baseada em BMKCloud: mineração de dados personalizada disponível na plataforma.

● Serviços pós-venda válidos por 3 meses após a conclusão do projeto

Requisitos de amostra e entrega

Biblioteca

Plataforma

Dados recomendados

Controle de qualidade de dados

depleção de rRNA

Illumina PE150

10GB

Q30≥85%

Conc.(ng/μl)

Quantidade (μg)

Pureza

Integridade

≥ 100

≥ 0,5

DO260/280=1,7-2,5

DO260/230=0,5-2,5

Contaminação limitada ou inexistente de proteínas ou DNA mostrada no gel.

Para plantas: RIN≥6,5;

Para animais: RIN≥7,0;

5,0≥28S/18S≥1,0;

elevação limitada ou nenhuma elevação da linha de base

Nucleotídeos:

Tecido: Peso (seco): ≥1g

*Para tecidos menores que 5 mg, recomendamos o envio de amostra de tecido congelado (em nitrogênio líquido).

Suspensão celular: Contagem de células = 3×107
*Recomendamos enviar lisado celular congelado.Caso a contagem de células seja menor que 5×105, recomenda-se o congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.

Amostras de sangue:
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzol e 2mL de sangue (TRIzol:Sangue=3:1)

Entrega de amostra recomendada
Recipiente: tubo de centrífuga de 2 ml (folha de estanho não é recomendada)
Rotulagem da amostra: Grupo+réplica, por exemplo, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Envio:
1.Gelo seco: As amostras precisam ser embaladas em sacos e enterradas em gelo seco.
2.Tubos RNAstable: As amostras de RNA podem ser secas em tubo de estabilização de RNA (por exemplo, RNAstable®) e enviadas em temperatura ambiente.

Fluxo de trabalho de serviço

CQ de amostra

Projeto de experimento

entrega de amostra

Entrega de amostra

Experiência piloto

Extração de RNA

Preparação da Biblioteca

Construção de biblioteca

Sequenciamento

Sequenciamento

Análise de dados

Análise de dados

Serviços pós-venda

Serviços pós-venda


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  • Bioinformática

    wps_doc_12

     

    1. Classificação LncRNA

    O LncRNA previsto pelos quatro softwares acima foi classificado em 4 categorias: lincRNA, LncRNA anti-sentido, LncRNA intrônico;sentido-LncRNA.A classificação do LncRNA foi mostrada no histograma abaixo.

    Classificação LncRNA

    Classificação LncRNA

    2. Genes direcionados a cis da análise de enriquecimento de DE-lncRNA

    O ClusterProfiler foi empregado na análise de enriquecimento GO em genes direcionados a cis de lncRNA diferencialmente expresso (DE-lncRNA), em termos de processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares.A análise de enriquecimento GO é um processo para identificar termos GO significativamente enriquecidos direcionados a DEG em comparação com o genoma inteiro.Os termos enriquecidos foram apresentados em histograma, gráfico de bolhas, etc. conforme mostrado abaixo.

    Análise de enriquecimento de genes-de-DE-lncRNA direcionados a cis - Gráfico de bolhasGenes direcionados a cis da análise de enriquecimento de DE-lncRNA - Gráfico de bolhas

     

    3. Ao comparar o comprimento, número de exon, ORF e quantidade de expressão de mRNA e lncRNA, podemos entender as diferenças na estrutura, sequência e assim por diante entre eles, e também verificar se o novo lncRNA previsto por nós está em conformidade com as características gerais.

    wps_doc_13

    Caso BMK

    Perfil desregulado de expressão de lncRNA em adenocarcinomas pulmonares de camundongos com mutação KRAS-G12D e nocaute P53

    Publicados:Jornal de Medicina Celular e Molecular,2019

    Estratégia de sequenciamento

    Iluminar

    Coleta de amostras

    As células KP (shRNA-2) knockdown NONMMUT015812 e as células de controle negativo (sh-Scr) foram obtidas no dia 6 de uma infecção viral específica.

    Principais resultados

    Este estudo investiga os lncRNAs expressos de forma aberrante no adenocarcinoma de pulmão de camundongo com nocaute P53 e a mutação KrasG12D.
    1,6424 lncRNAs foram expressos diferencialmente (alteração ≥ 2 vezes, P <0,05).
    2. Entre todos os 210 lncRNAs (FC≥8), a expressão de 11 lncRNAs foi regulada por P53, 33 lncRNAs por KRAS e 13 lncRNAs por hipóxia nas células KP primárias, respectivamente.
    3.NONMMUT015812, que foi notavelmente regulado positivamente no adenocarcinoma de pulmão de camundongo e regulado negativamente pela reexpressão de P53, foi detectado para analisar sua função celular.
    4. O knockdown de NONMMUT015812 por shRNAs diminuiu a proliferação e a capacidade de migração das células KP.NONMMUT015812 era um oncogene potencial.

    Estudo de caso de sequenciamento de RNA de comprimento total PB

    Análise da via KEGG dos genes diferencialmente expressos nas células KP knockdown NONMMUT015812

    Estudo de caso de sequenciamento de RNA de comprimento total PB

    Análise de ontologia genética dos genes diferencialmente expressos nas células KP knockdown NONMMUT015812

    Referência

    Perfil desregulado de expressão de lncRNA nos adenocarcinomas pulmonares de camundongos com mutação KRAS-G12D e nocaute P53 [J].Jornal de Medicina Celular e Molecular, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584

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